当归及其炮制品水提物体外抗脂质过氧化作用

为了研究当归及其不同炮制品水提物抗脂质过氧化的作用。采用体外小鼠肝组织自发性脂质过氧化、H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化和溶血反应,评价了当归及其炮制品水提物对脂质过氧化的抑制作用。结果表明当归及其不同炮制品水提物体外对肝组织自发性脂质过氧化的抑制能力为当归碳酒当归生当归油当归土当归;对H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制能力为当归碳土当归生当归酒当归油当归;对H2O2诱导的溶血作用的抑制能力为酒当归当归碳土当归油当归生当归,且抑制效果均呈现良好的剂量依赖关系。说明当归及其不同炮制品水提物体外都具有一定的抗脂质过氧化的作用,其中抗肝组织自发性脂质过氧化和H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的能力以当归碳最好,而抗H2O2诱导的溶血作用以酒当归最好。     

牦牛DBI基因的分子特征及其在乳腺组织中的表达与定位

地西泮结合抑制因子(Diazepam binding inhibitor,DBI)与酰基辅酶A具有高亲和力,在动物组织中广泛存在,与脂肪酸代谢、类固醇激素合成密切相关。为研究DBI基因的分子特征及该基因在乳腺发育中的作用,对牦牛DBI基因编码区进行克隆,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法对牦牛泌乳前期、泌乳期和干乳期的乳腺组织中DBI的相对表达量和表达部位进行研究。DBI序列分析显示：牦牛DBI基因编码区序列长264 bp,编码87个氨基酸残基,与牛的同源性高达99.62％;qPCR数据表明：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI基因的相对表达量显著高于泌乳期和干乳期(P< 0.05);WB结果显示：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI蛋白的表达量最高,干乳期次之,泌乳期最低(P< 0.05);IHC结果表明：不同发育时期的牦牛乳腺组织中DBI的表达部位并无明显差异,主要表达于乳腺腺泡上皮细胞、导管上皮细胞及小叶间质细胞。DBI在不同发育时期牦牛乳腺组织中的相对表达量具有明显差异(P< 0.05),揭示DBI可能参与牦牛乳腺发育的过程,这为进一步探究DBI基因在生物体中的作用提供相应的理论参考。     

基于氧化应激研究苦豆子不同提取物的肝毒性机制

基于亚急性毒性实验对苦豆子不同提取物肝毒性机制进行研究,为苦豆子临床安全使用提供理论依据。分别采用75%乙醇回流法(ER)、水煎煮法(WD)、75%乙醇超声法(EU)和水超声法(WU)制备苦豆子提取物,通过不同提取物的亚急性毒性实验测定大鼠肝组织中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽酶(GSH)、丙二醛(MDA)水平以评价其肝毒性;应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹方法测定氧化应激相关蛋白红系衍生的核因子2相关因子(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)表达,进一步探讨其肝毒性机制。结果显示,与空白组相比,AST在雄性大鼠各给药组血清中显著性升高,ALT在雌雄大鼠血清中均呈升高趋势,尤其在雄性WD、ER组、雌性WD、WU、EU组中有显著性差异。与空白组比较,雄性给药大鼠肝脏SOD和GSH在各组中均显著性降低,GSH在雌性大鼠肝组织中呈升高趋势,其中WD组有显著性差异,MDA在雌、雄给药大鼠肝脏中均显著升高。给药后,对Nrf2/HO-1氧化应激通路中相关蛋白检测后发现,Nrf2蛋白相较空白组在肝组织中表达均呈降低趋势,其中雄性WD、WU、EU组和雌性WD、EU、ER组最为显著,HO-1在雌雄各组肝组织表达中均发生显著性降低。SOD1在雌性各组中均有显著性降低,而在雄性中WD和ER组有显著性降低。本研究发现苦豆子不同提取物对大鼠肝脏都有一定的毒性,其毒性机制主要是通过调控Nrf2/HO-1通路中相关蛋白造成机体氧化应激而发生。     

藏羊大脑微动脉内皮特征与高原适应性研究

藏羊对严酷的自然环境具有良好的适应性,在高寒低氧时其脑血管仍能向脑组织充分供血.研究高原藏羊脑血管特别是微动脉解剖学特性有助于揭示其高原适应性机理.以欧拉型藏羊和生活在低海拔地区的滩羊的头部标本为试验材料,采用血管铸型结合扫描电镜技术,运用比较解剖学方法对二者大脑微动脉铸型表面特征开展研究.结果显示:藏羊60¹60μm直径的大脑微动脉铸型表面,有清晰的"椭圆形"或"足印状"内皮细胞核压痕,滩羊内皮细胞核压痕以"长条形"居多,压痕不如藏羊明显.藏羊200160μm直径的大脑微动脉铸型表面,有清晰的"椭圆形"或"足印状"内皮细胞核压痕,滩羊内皮细胞核压痕以"长条形"居多,压痕不如藏羊明显.藏羊200³00μm直径的大脑微动脉铸型表面,有相对粗大的平滑肌纤维压痕,而滩羊平滑肌纤维的压痕相对细小.研究推测,藏羊大脑微动脉的血管舒缩能力较强,能够及时有效地向各微动脉分支输送血液,因此在对大脑微动脉的血流调节方面,高原藏羊的功能会比低海拔绵羊更强,可能是其适应高原环境的解剖学特征之一.     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

猪线粒体控制区微卫星(mtMs)变异及其分布特征

猪线粒体DNA长度因D-loop中mtMs序列重复数变异而不同。为阐明猪mtMs变异及其在不同群体中的分布特征,本研究对4个藏猪群体、八眉猪、烟台黑猪及3个引入猪群体共164个个体mtDNA D-loop全序进行测定,并与GenBank中发表的相关序列进行比对,分析了其中的重复单元核苷酸变异、重复次数及其在各群体间的分布规律。结果表明,因重复单元“5’-TGCGTACACG-3’”第2~4和10位上碱基变异,猪mtMs形成了以其为核心序列的多种重复单元(R^A^R^G)组成的复合结构,重复数介于3~47之间。单一重复(R^A)组成的mtMs结构在各群体中表现出分布优势,而大多数复合结构(R^AR^B)分布在国外选育群体中。藏猪的mtMs复合结构多达8个,R^AR^CR^E为其特有,另有5个与八眉猪共享。中国野猪和韩国地方猪种也有其特有mtMs结构。丰富的mtMs变异和特有结构与长期适应进化有关,本研究为地方猪种遗传资源及适应性研究提供了标记工具和理论基础。     

MTNR1a和MTNR1b在牦牛不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

褪黑素对调节季节性繁殖哺乳动物的生殖具有重要调节作用。其受体MTNR1a（Melatonin receptor 1a,褪黑素受体1a）主要参与昼夜节律和生殖调控,MTNR1b（Melatonin receptor 1b,褪黑素受体1b）与多种疾病发生密切相关。为了探讨褪黑素受体基因的生物学功能,本实验对牦牛不同组织中MTNR1a、MTNR1b基因的表达与定位情况进行了研究。采用qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR) 检测成年雄性牦牛各组织及不同发育阶段（30日龄,2岁、4岁、6岁和8岁龄）牦牛睾丸组织中MTNR1a、MTNR1b mRNA的表达规律,并运用免疫组化技术对不同年龄牦牛睾丸中MTNR1a、MTNR1b蛋白进行了定位研究。结果发现,MTNR1a mRNA在松果体组织中表达量最高,肺脏、肌肉和睾丸次之;随着年龄增加,MTNR1a mRNA在睾丸中的表达量逐渐升高,到4岁后表达量趋于平稳;MTNR1a蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达,圆形精子呈现较强的免疫阳性,其次为初级精母细胞;MTNR1b mRNA在松果体表达量最高（P<0.05）,肾脏、肝脏和下丘脑次之;在不同年龄牦牛睾丸中MTNR1b mRNA均有表达,且随着年龄的增加表达量逐渐增加,在8岁时表达量最高;MTNR1b蛋白主要定位在圆形精子细胞中。MTNR1a、MTNR1b基因在牦牛不同组织及不同发育阶段睾丸中的广泛表达,揭示了其在雄性牦牛生殖等生理过程中的重要作用。     

藏绵羊子宫内膜炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立与评价

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后提取样品基因组。运用单一PCR法对600份样品基因组进行检测,记录阳性样品;再挑取单一PCR法检测的阳性样品进行多重PCR检测,再次记录阳性样品,通过计算两种检测方法的符合率验证多重PCR方法;随机挑出30份阳性样品,进行病原菌分离鉴定菌种种类。单一PCR检测的样品中,无乳链球菌感染比例占47.33%,大肠杆菌占34.83%,金黄色葡萄球菌占6.5%,未检出沙门氏菌和化脓隐秘杆菌;多重PCR检测的阳性样品中,无乳链球菌感染比例占45.50%,大肠杆菌占33.50%,金黄色葡萄球菌占6.5%;两种检测结果相比较,多重PCR检测出的符合率均高于95%;分离鉴定的病原菌与两种PCR方法检测出的菌种结果基本一致。成功建立了多重PCR方法并检测出引起青海藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响

【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9）技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T）细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（ubiquitin-specific protease 30,USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA （single guide RNAs,sgRNA）,分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。