四株不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒全基因组序列测定及比较分析

为了解析基因型相同但宿主来源不同的新城疫病毒的全基因组差异。本文采用RT-PCR方法分别获得4株（JS/3/09/Ch,ZJ/3/10/Ch,AH/2/10/Du,JS/9/08/Go）Class I 基因3型病毒的全基因组核苷酸序列,并与GenBank中已公布的Class I基因3型病毒全基因组序列进行比对分析。本实验4株病毒的基因组长度均为15198bp,在基因组1607～1608位有6碱基的缺失,在2381～2382位有12碱基的插入,裂解位点为112EQ/RQE/GRL117是标准弱毒特征。5株Class I基因3型病毒之间全基因组同源性超过93%;而与Class II弱毒株同源性最低只有72.2%;比较6个结构蛋白基因的同源性,NP基因的同源性最高(98.3%～96.4%),而P基因最低(96.1%～91.9%)。结果表明不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒在遗传信息方面差异不大,但NP/F/L基因的变异幅度较P/M/HN基因明显。     

CRISPR/Cas9介导的RPSA基因敲除细胞系的建立及其应用

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立RPSA基因缺失的乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cells,BHK21)细胞系,为开展RPSA调控病毒复制机制研究提供工具;同时,初步探究RPSA对塞内卡病毒复制的影响。【方法】根据GenBank中仓鼠的RPSA基因序列找到产生不同转录本的共同外显子段,设计并合成4对引导RNA(sgRNA),分别构建至PX330载体中;经过筛选选择打靶活性较高的PX330-RPSA-sgRNA2质粒用于后续敲除细胞系构建。将PX330-RPSA-sgRNA2质粒转染BHK21细胞后,通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Westernblot及序列测定检测RPSA基因的敲除。通过Westernblot及qPCR分析比较塞内卡病毒在野生型及RPSA基因敲除BHK21细胞中的复制差异。【结果】Western blot检测及序列测序证实了RPSA基因敲除单克隆细胞构建成功。进一步研究发现,塞内卡病毒在RPSA基因敲除细胞中的复制水平明显低于其在野生型BHK21细胞中复制的水平。【结论】成功构建了RPSA基因敲除的BHK21细胞系,首次表明RPSA对塞内卡病毒的复制具有重要作用,为进一步开展RPSA在细胞内调控病毒复制机制研究奠定基础。     

2017–2022年中国口蹄疫流行状况分析

【目的】分析近年来中国口蹄疫流行和传播特点,研判口蹄疫流行趋势。【方法】以2017-2022年间中国报告发生的口蹄疫疫情为研究对象,从疫情的“三间分布”、生产环节分布、流行毒株分子流行病学分析及溯源等方面,对近6年的疫情情况进行系统梳理。【结果】2017-2022年间中国共有15个省份报告发生口蹄疫疫情54次。总体形势稳定：Asia 1型口蹄疫维持无疫状态;2019-2022年连续4年未发生A型口蹄疫疫情;田间以散发O型口蹄疫为主。六年间报告牛口蹄疫疫情36次,羊疫情1次,猪疫情17次。分子流行病学研究表明,O/Mya-98、O/Ind-2001、O/CATHAY、O/PanAsia和A/Sea-97这5个流行毒株同时流行,且与同时期周边国家（缅甸、老挝和越南等）口蹄疫毒株遗传关系密切。流行病学调查结果显示,疫情（尤其是牛疫情,占比66.7%）主要发生在流通（57%）、散养（32%）等免疫薄弱环节。【结论】对内强化疫苗免疫和流通动物管控,对外严防境外毒株传入仍是今后中国口蹄疫防控的重要任务。     

CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响

【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9）技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T）细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（ubiquitin-specific protease 30,USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA （single guide RNAs,sgRNA）,分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。