口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNA Bac-N-Blue^TM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。     

猪IL-18在毕赤酵母中的表达及活性分析

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中扩增出IL-18基因并构建真核融合表达载体pPIC9K-IL-18,电激法转化入毕赤酵母GS115,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白用凝胶层析柱纯化后,用MTT法检测其生物学活性。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pIL-18,其表达在72h时达高峰,分泌量可达160mg/L,纯化的重组pIL-18蛋白具有显著的促进淋巴细胞增殖的活性,说明本试验已在毕赤酵母中在国内首次成功表达了具有生物学活性的pIL-18。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。     

脑红蛋白在赛加羚羊主要内脏器官中的表达与定位

赛加羚羊(Saiga tatarica)属于我国一级重点保护野生动物,其原产地主要为高寒低氧地区,现存种群则主要栖息于中亚地区的荒漠及半荒漠草原上。脑红蛋白是一种存在于脊椎动物体内具有运输和储存血氧能力的球蛋白,在动物适应低氧过程中具有重要的生理功能。为了初步探究赛加羚羊对低氧环境的耐受性机制,运用免疫组织化学染色法与实时荧光定量PCR技术,对脑红蛋白及脑红蛋白基因(NGB)在赛加羚羊的心、肝、脾、肺、肾等5种主要内脏器官中的分布规律与表达情况进行了探究。免疫组织化学染色结果显示,脑红蛋白在赛加羚羊的心、肝、脾、肺、肾中均有分布,阳性表达主要分布在其心肌细胞、肝细胞、脾白髓区中的淋巴细胞、肺泡细胞以及肾小球内皮细胞。实时荧光定量PCR结果显示,脑红蛋白基因在赛加羚羊心、肝、脾、肺、肾中的表达量不同,脾的表达量最高,心的表达量次之,两者均显著高于肝、肺和肾(P < 0.05);其后依次为肝、肾、肺,其中,肝的表达量显著高于肾和肺(P < 0.05),肾和肺之间表达量差异不显著(P > 0.05),肺的表达量最低。上述研究表明,脑红蛋白在赛加羚羊的主要内脏器官中均有阳性表达,不同内脏器官中的表达量不同,这表明脑红蛋白可能参与了这些内脏器官的氧利用过程,具体机制有待进一步探讨。     

非洲猪瘟病毒C717R蛋白诱导小鼠炎症应答

【目的】通过炎症应答系统筛选,发现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) C717R蛋白可诱导炎症反应,本研究旨在首次鉴定C717R蛋白功能,通过构建C717R重组慢病毒并感染BALB/c小鼠,探究其对炎症应答产生的影响。【方法】通过炎症小体表达系统筛选出诱导炎症应答的C717R蛋白,并构建C717R重组慢病毒。利用C717R重组慢病毒感染小鼠,使C717R在小鼠组织中表达。经实时荧光定量、蛋白质免疫印迹等方法检测C717R慢病毒包装、蛋白表达以及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β的变化。【结果】C717R蛋白在小鼠组织中正常表达。酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测发现,表达C717R蛋白的小鼠,血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β及IFN-γ分泌水平显著升高。实时荧光定量检测表达C717R蛋白的小鼠组织证实,C717R、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA转录水平显著上调;蛋白质免疫印迹证实,C717R可诱导小鼠不同组织caspase-1和IL-1β的成熟。组织病理切片结果显示,表达C717R蛋白的BALB/c小鼠和对照组和相比,肝脏、心脏、肺脏等器官炎性细胞浸润程度较对照组更严重。【结论】ASFV的C717R蛋白表达诱导BALB/c小鼠产生炎症应答,为鉴定和阐明C717R蛋白介导的促炎新机制提供了重要依据。     

基于16S rDNA扩增子测序技术揭示真胃左方变位对奶牛粪便微生物的影响

【目的】本试验旨在测定产后健康奶牛和罹患真胃左方变位(left displacement of the abomasum,LDA)奶牛粪便中微生物菌群的变化,以期探讨LDA发生与菌群的关联性,评估其对机体代谢的潜在影响。【方法】采用16S rDNA高通量测序技术,测定10头健康奶牛(Health)、10头真胃左方变位奶牛(LDA)粪便中微生物16SrDNAV3–V4区序列,并对菌群群落结构和多样性进行比较,分析其与LDA发生的相关性。【结果】多样性分析表明,Health组与LDA组奶牛的粪便中微生物多样性和群落组成存在较大的差异,其中LDA奶牛粪便微生物具有较高的物种丰度和种群差异性。对门、科、属3个分类水平上最大丰度排名前10的物种进行分析发现,LDA奶牛疣微菌门、蓝菌门、变形菌门、梭杆菌门、拟杆菌科、p-2534-18B5菌科、艰难杆菌科、梭杆菌科、螺旋菌属、5-7N15菌属和梭杆菌属的丰度显著升高(P<0.05),而螺旋体门、TM7菌门、瘤胃球菌科、理研菌科、密螺旋体属的丰度显著下降(P<0.05)。功能预测分析表明,LDA奶牛碳水化合物代谢和脂质代谢通路相关功能基因显著上调,而遗传信息处理相关功能基因显著下调。【结论】本试验研究了健康奶牛和LDA奶牛粪便微生物的变化,为LDA的致病机理、早期诊断提供了理论依据与研究基础。     

类芽孢杆菌QHZ11-gfp在马铃薯植株上的定殖特征及促生效果

[背景] 生防菌在作物根系的有效定殖是其功能发挥的前提,而直观的跟踪技术和有效的定量方法是研究生防菌根系分布规律的重要工具。[目的] 研究马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌（Rhizo ctonia solani） JT18的拮抗菌QHZ11在马铃薯植株上的定殖特征及对马铃薯的促生效果。[方法] 采用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）对QHZ11进行标记,将标记菌株菌悬液、生物有机肥和无菌水分别接种至灭菌土壤,通过激光共聚焦显微技术和实时荧光定量PCR等方法观察和测定标记菌株在马铃薯植株不同部位的定殖特征、数量变化及对马铃薯的促生效果。[结果] pHAPII质粒成功导入QHZ11并可稳定遗传40代,记为QHZ11-gfp;菌株标记前后的菌落形态、生长曲线和对R.solani JT18的拮抗能力等基本一致。从第7天开始,相继在马铃薯芽上和根上发现了绿色荧光,说明QHZ11-gfp成功定殖到了马铃薯的芽、根等部位。QHZ11-gfp在根系和匍匐茎的定殖数量均呈现先升高至块茎形成期达到峰值后下降的趋势,并且在整个生育期根系的定殖数量始终大于匍匐茎。菌悬液和生物有机肥处理均显著促进了马铃薯根系的生长,并通过增加株高等农艺性状提高了块茎产量。其中,生物有机肥处理在各部位的荧光强度、定殖数量和对马铃薯的促生效果均显著优于菌悬液。[结论] QHZ11-gfp可在马铃薯植株上成功定殖并对马铃薯有良好的促生效果,将其制成生物有机肥促进了其定殖,使促生效果也更好。     

赛加羚羊部分器官组织学结构观察

为了解世界濒危物种、国家Ⅰ级保护野生动物赛加羚羊（Saiga tatarica）主要器官组织的结构特征,本研究利用石蜡组织切片技术,对1只因胎衣不下死亡的雌性成年赛加羚羊心、肝、脾、肺、肾的组织结构进行了观察。赛加羚羊心肌纤维发达,呈圆柱状,有分支,其胞核位于细胞边缘,各心肌纤维分支末端相互连接构成肌纤维网,闰盘明显。肝组织致密,间质少,肝小叶分界不清,切面呈不规则的多边形,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。脾的被膜较厚,脾小梁由被膜和脾门的结缔组织伸入脾实质形成,相互连接构成脾的粗支架;实质部分可明显分为白髓和红髓,白髓主要分布在脾内小动脉周围,其内部脾小结形状为圆形或椭圆形;红髓主要分布于白髓区周围,其内充满大量的红细胞。肺实质导气部主要可见细支气管和终末细支气管,其中,细支气管的管腔面富含纵行皱襞,黏膜上皮为假复层柱状纤毛上皮;呼吸部可见大量的肺泡管、肺泡囊和肺泡,肺泡结构清晰可见。肾为平滑单乳头肾,由被膜和实质构成,实质可明显分为皮质与髓质,皮质内可见大量肾小体和少量结缔组织。总体而言,与其他同类型反刍动物相比较,赛加羚羊各主要器官的组织结构未见有明显差异。     

马麝出血症病毒VP60主要抗原表位区的串联表达及对家兔的免疫保护效力分析

马麝病毒性出血症(Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease,McVHD)为马麝的一种急性、高度致死性传染病,其病原马麝出血症病毒(Moschus chrysogaster hemorrhagic disease virus,McHDV)与兔出血症病毒高度同源。为了筛选McHDV保护性抗原,为McVHD疫苗研究奠定基础,文中通过对McHDV主要结构蛋白VP60抗原表位的分析,设计引物,应用RT-PCR技术扩增获得三段VP60主要抗原表位区核酸序列,并采用重叠延伸PCR将3段产物连接后克隆至原核表达载体pET-28a(+),成功构建原核表达质粒pET-truncated-VP60后转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫3–4月龄非RHD免疫兔,血凝抑制试验测定抗血清效价。首次免疫后21 d,通过攻毒保护试验分析重组蛋白的免疫保护效力。结果表明,McHDV VP60主要抗原表位蛋白在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子质量约为45 kDa,且以包涵体形式存在;重组蛋白纯化后配制疫苗免疫的新西兰白兔,可100%抵抗McHDV株的攻击,表明所筛选的抗原表位串联表达的重组蛋白具有良好的免疫保护效力,研究结果为McVHD新型疫苗的研发奠定了基础。