| CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响 |
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| 引用本文： | 赵振翔,张向乐,杨帆,曹伟军,顾峰幸,李康丽,郑海学,王雯慧,朱紫祥.CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响[J].微生物学报,2023,63(10):4064-4074. |
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| 作者姓名： | 赵振翔 张向乐 杨帆 曹伟军 顾峰幸 李康丽 郑海学 王雯慧 朱紫祥 |
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| 作者单位： | 甘肃农业大学动物医学院, 甘肃 兰州 730070;中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州大学动物医学与生物安全学院 动物疫病防控全国重点实验室, 甘肃 兰州 730046 |
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| 基金项目： | 国家重点研发计划（2021YFD1800300）；甘肃省重大专项（21ZD3NA001，20ZD7NA006，19ZDNA001）；“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（2022SDZG02）；生猪产业体系（CARS-35）；甘肃省优秀博士生项目（23JRRA559）；兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金（lzujbky-2022-13） |
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| 摘 要： | 【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293T cells，HEK-293T）细胞系，为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（ubiquitin-specific protease 30，USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型；同时，初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列，定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段，设计并合成2对引导RNA （single guide RNAs，sgRNA），分别构建在pX459载体中；将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞，并用嘌呤霉素处理，筛选出转染阳性的细胞，然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞，通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现，SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系，首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用，为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型，也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas9 泛素特异性蛋白酶30 基因敲除细胞 塞内卡病毒 |
| 收稿时间： | 2023/2/20 0:00:00 |
| 修稿时间： | 2023/5/12 0:00:00 |
HEK-293T cells with USP30 knockout: construction using the CRISPR/Cas9 system and effects on Senecavirus A replication |
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| ZHAO Zhenxiang,ZHANG Xiangle,YANG Fan,CAO Weijun,GU Fengxing,LI Kangli,ZHENG Haixue,WANG Wenhui,ZHU Zixiang.HEK-293T cells with USP30 knockout: construction using the CRISPR/Cas9 system and effects on Senecavirus A replication[J].Acta Microbiologica Sinica,2023,63(10):4064-4074. |
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| Authors: | ZHAO Zhenxiang ZHANG Xiangle YANG Fan CAO Weijun GU Fengxing LI Kangli ZHENG Haixue WANG Wenhui ZHU Zixiang |
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| Institution: | College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, College of Veterinary Medicine, Lanzhou University, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | CRISPR/Cas9 ubiquitin-specific protease 30 cells with gene knockout Senecavirus A |
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