藏绵羊子宫内膜炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立与评价

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后提取样品基因组。运用单一PCR法对600份样品基因组进行检测,记录阳性样品;再挑取单一PCR法检测的阳性样品进行多重PCR检测,再次记录阳性样品,通过计算两种检测方法的符合率验证多重PCR方法;随机挑出30份阳性样品,进行病原菌分离鉴定菌种种类。单一PCR检测的样品中,无乳链球菌感染比例占47.33%,大肠杆菌占34.83%,金黄色葡萄球菌占6.5%,未检出沙门氏菌和化脓隐秘杆菌;多重PCR检测的阳性样品中,无乳链球菌感染比例占45.50%,大肠杆菌占33.50%,金黄色葡萄球菌占6.5%;两种检测结果相比较,多重PCR检测出的符合率均高于95%;分离鉴定的病原菌与两种PCR方法检测出的菌种结果基本一致。成功建立了多重PCR方法并检测出引起青海藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。     

牦牛DBI基因的分子特征及其在乳腺组织中的表达与定位

地西泮结合抑制因子(Diazepam binding inhibitor,DBI)与酰基辅酶A具有高亲和力,在动物组织中广泛存在,与脂肪酸代谢、类固醇激素合成密切相关。为研究DBI基因的分子特征及该基因在乳腺发育中的作用,对牦牛DBI基因编码区进行克隆,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法对牦牛泌乳前期、泌乳期和干乳期的乳腺组织中DBI的相对表达量和表达部位进行研究。DBI序列分析显示：牦牛DBI基因编码区序列长264 bp,编码87个氨基酸残基,与牛的同源性高达99.62％;qPCR数据表明：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI基因的相对表达量显著高于泌乳期和干乳期(P< 0.05);WB结果显示：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI蛋白的表达量最高,干乳期次之,泌乳期最低(P< 0.05);IHC结果表明：不同发育时期的牦牛乳腺组织中DBI的表达部位并无明显差异,主要表达于乳腺腺泡上皮细胞、导管上皮细胞及小叶间质细胞。DBI在不同发育时期牦牛乳腺组织中的相对表达量具有明显差异(P< 0.05),揭示DBI可能参与牦牛乳腺发育的过程,这为进一步探究DBI基因在生物体中的作用提供相应的理论参考。     

FSH促进牦牛输卵管上皮细胞分泌输卵管特异性糖蛋白的研究

为在胚胎共培养过程中添加相关激素提高哺乳动物胚胎发育的研究提供理论依据,本研究探讨了促卵泡生成素(FSH)对牦牛输卵管上皮细胞分泌特异性糖蛋白的影响。体外分离培养牦牛输卵管上皮细胞,并在细胞中添加不同浓度的FSH,作用6 h后运用荧光定量PCR分析输卵管特异性糖蛋白mRNA的表达水平,并用细胞免疫标记对其分泌输卵管蛋白的部位进行分析。结果显示,FSH的浓度为0.5-5.0μg/m L时,输卵管蛋白的表达量随着FSH浓度的上升而增加,在5.0μg/m L的FSH作用后,输卵管蛋白的mRNA表达量最高;浓度超过10.0μg/m L时,输卵管蛋白基因的表达量降低。结果表明,FSH具有促进输卵管上皮细胞分泌输卵管特异性糖蛋白的作用,且具有剂量依赖性,其最佳作用浓度为5.0μg/m L,输卵管蛋白主要由细胞质分泌。     

牦牛LIFR 基因的克隆及其在繁殖周期卵巢中的表达

白血病抑制因子受体(LIFR)与白血病抑制因子(LIF)结合,在排卵、胚胎发育及胚胎附植等过程中起重要的调节作用,与哺乳动物生殖过程密切相关。为进一步研究白血病抑制因子受体(LIFR)基因在卵巢中的表达,本研究对牦牛LIFR 基因进行克隆和序列分析,并利用RT-PCR 技术研究其在繁殖周期卵巢中的表达情况。本研究克隆得到牦牛3 329 bp 的LIFR 基因cDNA 序列,内含3 288 bp 开放阅读框序列。与家牛的相应序列具有很高的同源性(99 5% ),表明LIFR 基因在进化过程中较为保守。实时定量RT-PCR 检测LIFR 基因在繁殖周期卵巢中的表达,结果显示卵巢中LIFR 基因在妊娠期表达最强。表明LIFR 基因在牦牛繁殖周期中具有不可忽视的作用。     

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

以牦牛血小板活化因子受体(Platelet-activating factor receptor,PAFR)基因为研究对象,采取西宁家养牦牛子宫为材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因,对其进行生物信息学分析,并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明,牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp,编码342个氨基酸;氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%,与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%,表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性;其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域,推测其可能为跨膜蛋白;具有亲水性;未发现信号肽片段;含有G蛋白偶联受体家族结构域;QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达,妊娠期最高,卵泡期最低,黄体期居中,揭示其与胚胎附植,妊娠维持有关。     

牦牛Atg5基因克隆及其在输卵管、卵巢和子宫中的表达定位

自噬是一种保守的细胞内降解过程,在多种生物体内证实自噬有重要的生物学意义。但是自噬在牦牛这一高原特色物种体内的研究未见报道。因此为探索正常生理条件下自噬相关基因在牦牛生殖过程中的表达,本研究分别采集牦牛不同繁殖周期（卵泡期、黄体期及妊娠期）的主要生殖器官（输卵管、卵巢、子宫）,克隆牦牛自噬相关基因5（Autophagy related 5,Atg5）基因并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测Atg5 基因在组织中的相对表达量;并采用蛋白质免疫印迹（Western-blot, WB）检测Atg5和Atg5-Atg12（Autophagy related 12,自噬相关基因12）复合体在不同组织中的表达水平;免疫组织化学方法分析Atg5在各生殖器官中的分布特征。结果显示,成功克隆牦牛Atg5基因在进化过程中高度保守,编码的蛋白质为可溶性的非跨膜蛋白;qRT-PCR和WB检测结果显示Atg5和Atg5-Atg12复合体在牦牛输卵管、卵巢和子宫中均有表达。其中卵泡期卵巢Atg5-Atg12表达显著高于黄体期和妊娠期,卵泡期Atg5的表达却显著低于黄体期和妊娠期;黄体期输卵管Atg5-Atg12表达量显著高于卵泡期和妊娠期,妊娠期输卵管中Atg5的表达量显著高于卵泡期和黄体期;卵泡期和妊娠期子宫中Atg5-Atg12的表达量显著高于黄体期,而黄体期子宫中的Atg5的表达量又显著高于妊娠期和卵泡期,在蛋白水平上Atg5和Atg5-Atg12的表达呈负相关。免疫组织化学结果显示Atg5在输卵管黏膜上皮,卵巢卵泡膜、颗粒层、生殖上皮、黄体细胞,子宫内膜和子宫腺体均有表达。研究结果表明自噬在牦牛体内与其他物种相似具有保守性,通过检测Atg5-Atg12复合体在牦牛生殖器官中的表达,推测自噬可能参与牦牛生殖生理过程的调控。该研究结果对自噬在其他大型哺乳动物以及高寒低氧环境中动物的研究具有借鉴意义,有助于自噬参与其他动物生殖生理作用机制的研究。