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转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基囚工程疫苗研制提供科学依据.[方法]从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建莺组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D.用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12 d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆.[结果]应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中.经SDS-PAGE、Western blot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达.[结论]本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据. 相似文献
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PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1( );另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGET^TM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。 相似文献
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口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析 总被引:1,自引:0,他引:1
口蹄疫(FMD)是严重影响全球农业经济的高度传染的毁灭性的疫病.3D蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)编码的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制.利用PCR扩增得到了FMDV的3D基因片段,然后将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pETFM3D.转化宿主菌BL21(DE3)后,利用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western boltting分析结果表明,得到了稳定、过量表达的可溶性的3D蛋白质.目的蛋白质经NI亲和层析柱一步纯化就达到95%,再经Q-sepharose柱纯化后达到97%.通过圆二(CD)色谱测定和计算3D蛋白质在不同的pH(2、4、6、8和10)和不同的温度下(25~85℃)的二级结构.上述结果表明,表达的可溶性3D蛋白质具有高表达、易纯化和稳定性好等特点. 相似文献
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口蹄疫病毒A/AKT/58株基因组全长感染性cDNA克隆的体内拯救 总被引:1,自引:0,他引:1
构建了两种口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因组全长cDNA克隆DTA/FMDV和pCA/FMDV,利用体外转录和体内转录方法制备感染性病毒,并对其抗原性,乳鼠毒力(LD50)和病毒生长动力学等生物学特性进行了分析。为了鉴别野毒与重组病毒,利用融合PCR技术在两种全长cDNA基因组内分别引入了几个点突变(pTA/FMDV;T1029G,pCA/FMDV:A174G,A308G,T1029G)作为遗传标记。结果表明,两种重组病毒对3日龄乳鼠均表现致病性。但是由pTA/FMDV合成的感染性体外转录本RNA的毒力较弱(10^-6);而与pCT7RNAP质粒共转染的pCA/FMDV体内拯救病毒的毒力较强(10^-7.5),并在BHK-21细胞上表现出与野毒相似的生长特性。这一结果表明,在FMDV的拯救过程中,以pCT7RNAP为基础的体内拯救系统相比体外转录方法更为简便、实用。该系统为利用反向遗传操作技术深入研究FMDV的分子致病机制及其准种特性等奠定了良好的基础。 相似文献
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【目的】分析近年来中国口蹄疫流行和传播特点,研判口蹄疫流行趋势。【方法】以2017-2022年间中国报告发生的口蹄疫疫情为研究对象,从疫情的“三间分布”、生产环节分布、流行毒株分子流行病学分析及溯源等方面,对近6年的疫情情况进行系统梳理。【结果】2017-2022年间中国共有15个省份报告发生口蹄疫疫情54次。总体形势稳定:Asia 1型口蹄疫维持无疫状态;2019-2022年连续4年未发生A型口蹄疫疫情;田间以散发O型口蹄疫为主。六年间报告牛口蹄疫疫情36次,羊疫情1次,猪疫情17次。分子流行病学研究表明,O/Mya-98、O/Ind-2001、O/CATHAY、O/PanAsia和A/Sea-97这5个流行毒株同时流行,且与同时期周边国家(缅甸、老挝和越南等)口蹄疫毒株遗传关系密切。流行病学调查结果显示,疫情(尤其是牛疫情,占比66.7%)主要发生在流通(57%)、散养(32%)等免疫薄弱环节。【结论】对内强化疫苗免疫和流通动物管控,对外严防境外毒株传入仍是今后中国口蹄疫防控的重要任务。 相似文献
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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的高度接触性传染病,是严重危害养猪业的传染病之一。CSFV基因组为单股正链RNA分子,长约12.3kb,仅编码一个开放性阅读框。位于5′端的囊膜糖蛋白Erns、E1和E2构成了CSFV的外壳,其中Erns 相似文献
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采用富集定向筛选法,从旱地小麦的根际土壤中分离到2株产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的菌株AS和CS。经测定菌株AS和CS的ACC脱氨酶的比活力分别为0.018 6 U/mg和0.016 7 U/mg蛋白。根据培养特征观察和生理生化指标测定结果,结合16S rDNA碱基序列测定和系统发育同源性分析,确定菌株AS和菌株CS分别属于霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)和变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)。 相似文献
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将猪瘟病毒不同抗原表位基因串联构成重组基因BT21,化学合成后克隆至pMD18-T载体中,然后再将BT21串联基因片段插入原核表达载体pGEX-6P-1。经酶切和测序鉴定后,构建的重组质粒pGEX—BT21转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE分析,用G1utathione Se-pharose4B亲和层析法纯化目的蛋白和Western blot分析其免疫学活性。结果表明:融合蛋白GST—BT21以可溶形式表达,分子量约为33kDa,与预期大小相符,纯化的重组蛋白可被猪瘟病毒阳性血清所识别,具有良好的免疫学活性。从而为进一步研究该融合蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。 相似文献
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