FMDV整联蛋白受体b1亚基的克隆及其配体黏附区多抗的制备

采用RT-PCR技术从牛气管组织扩增出2400 bp的b1基因, 回收纯化连入PGEM-T载体, 测序。用Expasy软件对b1基因的抗原性进行分析, 选取胞外区334~861 bp的配体结合区与6×His融合, 在大肠杆菌中大规模诱导表达, 并经Ni2+亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE鉴定后, 应用纯化蛋白免疫新西兰家兔, 获得效价在1:12 800以上的多抗, Western blotting鉴定表明此抗体可特异性的与表达的融合蛋白作用。     

毕赤酵母表达系统

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS－PAGE和Western blit结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P.pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

我国贫困地区医疗卫生服务体系建设探讨

健康扶贫是提高贫困地区人民群众的健康水平、实现健康中国的重要途径。构建和完善中国贫困地区的医疗服务体系,要重点加强医疗卫生机构标准化建设、公共卫生服务网络建设、远程医疗服务体系建设和中医药服务能力建设等方面,形成与当地经济发展和健康需求相适应的医疗卫生服务体系,保障贫困人群的健康,最终实现全民健康。     

猪水疱病病毒致病和免疫的分子基础

猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)属于小RNA病毒科(Picornavirdae)肠道病毒属(Enterovirus),其抗原特性与柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus B5,CVB5)关系密切,被认为是CVB5的一个猪变种或亚种[1].SVDV只有一个血清型,但对其分离株进行系统发生分析可进一步分为4个抗原群或基因群[2,3].第1群包含SVDV早期分离株(ITL/1/66),第2群包含1972～1981年间欧洲和日本分离株,第3群包含意大利1988年12月～1992年6月间的分离株,第4群包含1987～1994年间,罗马尼亚、荷兰、意大利和西班牙的分离株.     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1疫苗毒及其N蛋白对山羊PBMCs免疫效应的影响

小反刍兽疫(PPR)是羊、骆驼等小反刍动物的一种急性、烈性、接触性A类传染病,发病率和致死率极高.目前,PPR在全球仍呈现区域性流行和多地散发势态.为探讨PPRV及N蛋白体外诱导山羊外周血单个核细胞(PBMCs)在不同时间对PBMCs免疫应答效应的影响.本研究将PPRVNigeria75/1疫苗毒(1 MOI)、重组N蛋白(10μg/mL)和RPMI 1640(阴性对照)体外刺激PBMCs 48h、72h、96h.采用CCK-8法检测PBMCs细胞增殖情况;qRT-PCR及ELISA检测炎症因子包括IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a和IFN-γ的mRNA表达水平及分泌情况;流式细胞术检测T细胞CD4+和CD8+的表达、及单核来源树突状细胞(DCs)表面分子CD40、CD86、CD80的表达、以及检测PPRV感染PBMCs引起的细胞凋亡.研究发现:与对照组相比,PPRV能够抑制PBMCs的体外增殖,显著促进炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表达(P＜0.05).并且PPRV感染PBMCs产生细胞凋亡,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞表达.另外PPRV体外刺激DCs,CD40、CD86、CD80的表达显著升高(P＜0.05),提示PPRV具有刺激DCs细胞成熟与分化的功能.进一步研究发现PPRV N蛋白体外刺激PBMCs能引起与PPRV作用相同的免疫效应.本研究表明PPRV Nigeria75/1疫苗毒体外感染PBMCs主要引起炎症反应与细胞凋亡、促进单核来源DCs成熟与分化,并且N蛋白参与PPRV引起的各项免疫功能.     

猪水疱病病毒外壳蛋白的二级结构和抗原表位预测

以SVDV外壳蛋白基因序列为基础,采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson 法和Karplus-Schulz法预测蛋白质的二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测SVDV外壳蛋白的B细胞表位。预测结果表明,SVDV外壳蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋和β-折叠区段;SVDV外壳蛋白的VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,其中,VP1蛋白的B细胞表位优势区域比VP2和VP3蛋白的多,与已鉴定的B细胞表位相比较,该方法预测的结果有较高的准确度。为实验确定SVDV外壳蛋白的B细胞表位和反向疫苗学设计提供理论基础。     

口蹄疫病毒O/QYYS/s/06株感染性克隆的构建

本研究在完成FMDVO/QYYS/s/06株全基因组序列测定的基础上,分3段对全基因组进行克隆,其后将各片段克隆到载体P43中,从而获得携带O/QYYS/s/06株基因组全长cDNA的重组质粒P43C。将重组质粒P43C与表达RNA聚合酶的质粒T7共转染BHK-21细胞,48h后收获培养液接种2~3d乳鼠,取经乳鼠传代后的第4代病毒液,经反向间接血凝、中和试验和测序等方法证明拯救的病毒为O型FMDV。以上结果表明,O/QYYS/s/06株全长cDNA分子克隆的构建成功。     

三株牛源亚洲1型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的亚洲1型口蹄疫病毒(分别命名为F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的片段,并测定了3个毒株VP1基因的序列.结果表明,3株亚洲1型FMDV毒株VP1基因长度均为633 bp,编码211个氨基酸.3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在82.8% ～99.1%之间,推导氨基酸序列同源性在89.1% ～99.1%之间.从系统发生树看,F1株与我国香港2005年牛毒株序列同源性99.5%,属同一遗传谱系,F2株、F3株与2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一个基因群.