共表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性

[目的]筛选稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)株.[方法]采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法从重组质粒pMD-P1-2A和pMD-3C中分别扩增口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因,将两基因依次插入逆转录病毒载体pBABE-puro.重组逆转录病毒载体pBABE-puro/P1-2A-3C和pVSV-G质粒载体用脂质体介导共转染GP2-293包装细胞.产生的重组逆转录病毒感染MDBK细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性细胞.利用克隆环套取法得到单克隆细胞.经间接免疫荧光和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法检测MDBK细胞中衣壳蛋白的表达,并在电镜下观察口蹄疫病毒空衣壳.[结果]成功筛选到稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的MDBK细胞株,衣壳前体蛋白P1-2A在蛋白酶3C裂解作用下正确组装成空衣壳.[结论]该研究为口蹄疫亚单位疫苗的研制提供了实验材料.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力

【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a(+)中.3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物.利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDV RNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组.     

携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板, 反转录并扩增目的cDNA。通过分子克隆技术将前导蛋白编码序列Lab与逆转录病毒载体pBPSTR1连接, 将构建正确的重组载体命名为pBPSTR1-Lab。通过分别利用不同浓度的嘌呤霉素和四环素来确定最佳筛选浓度和最佳调控浓度, 结果显示嘌呤霉素的最佳筛选浓度为3 mg/mL, 四环素的最佳调控浓度为1 mg/mL。利用pBPSTR1-Lab和包装质粒pVSV-G双质粒瞬时转染Gp2-293包装细胞来获得重组逆转录病毒。利用重组逆转录病毒来感染牛肾细胞, 并连续筛选12天来获得阳性克隆。通过除去四环素来诱导目的基因在牛肾细胞中表达, 发现牛肾细胞病变死亡。经过PCR和蛋白质免疫印迹证实稳定表达前导蛋白的牛肾细胞系已经建立, 为今后研究前导蛋白致病机理提供了平台。     

携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板, 反转录并扩增目的cDNA。通过分子克隆技术将前导蛋白编码序列Lab与逆转录病毒载体pBPSTR1连接, 将构建正确的重组载体命名为pBPSTR1-Lab。通过分别利用不同浓度的嘌呤霉素和四环素来确定最佳筛选浓度和最佳调控浓度, 结果显示嘌呤霉素的最佳筛选浓度为3 mg/mL, 四环素的最佳调控浓度为1 mg/mL。利用pBPSTR1-Lab和包装质粒pVSV-G双质粒瞬时转染Gp2-293包装细胞来获得重组逆转录病毒。利用重组逆转录病毒来感染牛肾细胞, 并连续筛选12天来获得阳性克隆。通过除去四环素来诱导目的基因在牛肾细胞中表达, 发现牛肾细胞病变死亡。经过PCR和蛋白质免疫印迹证实稳定表达前导蛋白的牛肾细胞系已经建立, 为今后研究前导蛋白致病机理提供了平台。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a( )中。3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物。利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDVRNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装

PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1( );另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGET^TM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET／P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

利用脊髓灰质炎病毒5'NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。     

口蹄疫病毒WFL株ORF基因真核表达质粒的构建及病毒的拯救

本研究构建FMDV WFL株ORF(open reading frame)基因真核表达质粒pEGFP-C1-A3I3,并进行了表达研究和共转染研究。结果发现,该质粒可以在BHK-21细胞中表达。将其与体外转录获得的FMDV RNA共转染BHK-21细胞后,用夹心ELISA、RT-PCR法以及电镜观察证明共转染后的细胞培养液中有病毒粒子,且病毒量高于单独转染RNA所得病毒量。证明用FMDV基因组真核表达质粒与其基因组体外转录RNA共转染敏感细胞可提高拯救病毒的数量。     

转录后水平沉默与基因表达

基因沉默是1个非常复杂和普遍的现象。转录后水平的基因沉默是指转基因在细胞核里能稳定转录,细胞质里却无相应的稳定态mRNA存在的现象。它往往被称为共抑制、静息作用或RNA干预等。本文介绍了转录后水平的基因沉默现象的发现、分子机理和应用等方面的进展。提出了克服转录后水平基因沉默的一些对策。     

基因治疗中外源基因的导入

基因治疗是将遗传物质导入靶细胞以达到治疗疾病的目的,目前基因治疗研究中的主要障碍是如何格外源基因导入靶细胞。本介绍基因治疗的原理和外源基因导入靶细胞时的常用方法,包括显微注射法、电穿孔法、基因枪粒子轰击法等。对基因治疗的现状、存在的问题及未来发展前景作了简要探讨。     

Human globin gene expression after gene transfer

Human globin genes can be transferred into mouse and human erythroid cells in culture, and can be appropriately expressed at the mRNA level in these cells. A plasmid containing a human beta globin gene is expressed in mouse erythroleukemia cells (MELC), and another containing a human epsilon or gamma gene is expressed in human erythroleukemia (K562) cells. A neomycin resistance (neoR) gene on the plasmids has been used to select for those cells containing the transferred globin genes; this selection may favor the expression of the globin genes by providing chromosomal positions requiring neoR expression. Analyzing clones resistant to G418, a neomycin analogue, demonstrated globin mRNA expression and induction. Retroviral vectors have also been used to transfer and appropriately express human beta genes in MELC. In addition, a plasmid containing a dihydrofolate reductase (DHFR) gene as well as neoR and beta globin genes has been used to amplify and express beta globin mRNA in MELC. These experiments suggest that high level appropriate expression of human beta globin genes is feasible and provides potentially useful approaches to the long-range goal of gene therapy for sickle cell anemia and beta thalassemia.     

SNAPper: gene order predicts gene function

SNAPper is a network service for predicting gene function based on the conservation of gene order. AVAILABILITY: The SNAPper server is available at http://pedant.gsf.de/snapper. SNAPper-based functional predictions will soon be offered as part of the PEDANT genome analysis server http://pedant.gsf.de.     

Horizontal gene transfers as metagenomic gene duplications

While it is well accepted that horizontal gene transfer plays an important role in the evolution and the diversification of prokaryotic genomes, many questions remain open regarding its functional mechanisms of action and its interplay with the extant genome. This study addresses the relationship between proteome innovation by horizontal gene transfer and genome content in Proteobacteria. We characterize the transferred genes, focusing on the protein domain compositions and their relationships with the existing protein domain superfamilies in the genome. In agreement with previous observations, we find that the protein domain architectures of horizontally transferred genes are significantly shorter than the genomic average. Furthermore, protein domains that are more common in the total pool of genomes appear to have a proportionally higher chance to be transferred. This suggests that transfer events behave as if they were drawn randomly from a cross-genomic community gene pool, much like gene duplicates are drawn from a genomic gene pool. Finally, horizontally transferred genes carry domains of exogenous families less frequently for larger genomes, although they might do it more than expected by chance.