α-α交联的Fe-Co杂化血红蛋白的轴向键Fe-Nε共振拉曼谱研究

通过将HbA和变异HbC(Glu6→Lys)交联制得的各种Co取代的Fe-Co杂化血红蛋白进行血红蛋白氧合过程的模拟研究,用共振拉曼技术研究它们在载氧、去氧和一氧化碳配位(无IHP或有IHP)时的轴向共价键Fe-Nε(F8-His)伸缩振动证明,在血红蛋白配位过程中,第一个配体配位到β(Fe)亚基上所引起的构象变化比配位到α(Fe)亚基的大;因而,配位分子应首先结合在α(Fe)亚基上,血红蛋白四聚体配位过程T/R态构象根本转变发生在第二个配位之时或之前;而且,可能存在除T、R态外的其它构象状态。     

氧化棉子糖分子内交联猪血红蛋白对其结构功能的影响

用高碘酸盐氧化法制得氧化开环棉子糖,并用它分别修饰处在氧合及脱氧构象的猪血红蛋白得到两种不同的修饰衍生物。与天然蛋白质相比,两种修饰后的猪血红蛋白衍生物均具有明显的抗α２β２四聚体解聚的特性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和反相ＨＰＬＣ分析发现这两种修饰衍生物均为分子内交联产物,而且交联都发生于２个β亚基之间,两种交联产物的紫外－可见光谱没有明显差别,但在相同浓度下,脱氧构象下被修饰蛋白质的荧光发射光强度明显     

α-α交联的Fe-Co杂化血红蛋白的轴向键Fe-Nε共振拉曼谱研究

通过将HbA和变异HbC(Glu6→Lys)交联制得的各种Co取代的Fe-Co杂化血红蛋白进行血红蛋白氧合过程的模拟研究,用共振拉曼技术研究它们在载氧、去氧和一氧化碳配位(无IHP或有IHP)时的轴向共价键Fe-Nε(F8-His)伸缩振动证明,在血红蛋白配位过程中,第一个配体配位到β(Fe)亚基上所引起的构象变化比配位到α(Fe)亚基的大;因而,配位分子应首先结合在α(Fe)亚基上,血红蛋白四聚体配位过程T/R态构象根本转变发生在第二个配位之时或之前;而且,可能存在除T、R态外的其它构象状态。     

聚乙二醇大分子化猪血红蛋白对其携氧特性的影响

用PEG共轭结合猪血红蛋白(pHb)以增大总分子量是延长它在血液循环系统中存留时间的有效方法。作为一种线性的亲水大分子,PEG对pHb的共轭会对它的携氧特性产生显著影响。研究了pHb处于不同空间构象(脱氧的T构象或氧合的R构象)、PEG修饰程度的高低、修饰用PEG的分子量的大小、有无别构效应调节剂等不同条件下PEG修饰对pHb携氧能力的影响。进而又用了PEG修饰已经用双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯(DBBF)分子内交联的pHb,考察修饰对这种内交联pHb携氧功能的影响。还比较了4种不同方法活化的PEG衍生物,对pHb修饰效率、对修饰产物携氧功能的影响及修饰产物稳定性等。本文认为,DBBF分子内交联的pHb,在有别构效应调节剂的存在下,再用PEG修饰,可以获得携氧能力好、分子量适宜、四聚体稳定的修饰产物。     

人肾液泡型H＋－ATPase 58kD亚基基因的表达

在大肠杆菌中表达了人肾液泡型H^＋-ATPase 58kD亚基的基因,利用聚合酶链式反应(PCR)得到了58kD亚基的编码片段.直接将PCR产物连接到PET载体上表达.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明58kD亚基的基因得到高效表达.表达产物可达细菌细胞质蛋白的50%.     

Disuccinimidyl suberate cross-linked hemoglobin as a novel red blood cell substitute

Disuccinimidyl suberate (DSS) intramolecularly cross-linked hemoglobin (Hb) was developed as a novel red blood cell substitute. A multi-angle laser light scattering detector coupled with size exclusion HPLC was applied to determine the molecular weight of the modified Hb. SDS-PAGE was also used as a complement. It was proved that 83.8% of the product was intramolecularly cross-linked Hb with weight-average molecular weights (Mw) of 67.5 kD, 12% was dimeric Hb with Mw of 146.6 kD, and 4.2% was trimeric Hb with Mw of 306.4 kD. The tetramer structure of the cross-linked Hb was stable as shown in size-exclusion chromatography using a mobile phase containing 1 mol/L MgCI2. Analysis by LC-MS demonstrated that the reaction of DSS with Hb mainly took place between the two a subunits within a Hb molecule, resulting in stabilization of the tetramer structure. However, the cross-linking was not site-specific. The P50 of the cross-linked Hb decreased from 21.8 mmHg to 14.3 mmHg, and the Hill coefficient decreased from 2.22 to 1.41. Result of isoelectric focusing showed that the pi of DSS cross-linked Hb was in the range of 4.6-5.2, similar to that of serum albumin. The safety of DSS cross-linked Hb was favored by animal tests on rats and guinea pigs. Exchange transfusion experiment with DSS cross-linked Hb using rats as a model indicated no pressor effect or other significant side effects. The characteristics and properties of DSS cross-linked Hb were also compared with that of diaspirin cross-linked Hb reported in the literature.     

Gβ1γ2蛋白的纯化及其与腺苷酸环化酶的互作关系

对G蛋白β₁γ₂亚基及偶联组分在信号传导中的作用进行了初步研究. 以离体昆虫细胞Sf9(Spodoptera frugiperda, 秋粘虫卵巢细胞)或H5(Trichoplusia ni, 粉纹夜蛾细胞)为生物反应器, 高效表达了G蛋白β₁γ₂亚基. 用Ni-NTA亲和层析柱, 经快速蛋白纯化技术(FPLC)获得高纯度的Gβ₁γ₂. 活性测定表明, 纯化的GGβ₁γ₂能显著刺激腺苷酸环化酶(AC2)的活力. 应用基于表面胞质团共振现象的BIAcore技术, 采用生物传感芯片NTA(biosensor chip NTA)直接证明腺苷酸环化酶2 (AC₂)的胞质末端C₂区域为G蛋白β₁γ₂亚基的结合区, 从而明确了二者互作的活性位点和结合位点同位于该区域.     

丝裂原活化蛋白激酶介导脱乙酰几丁质诱导的人参细胞氧迸发与皂苷合成

脱乙酰几丁质(chitosan, CHN)可以特异性诱导人参细胞42与39 kD蛋白激酶活性, 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径的抑制剂PD98059可以抑制CHN的这种诱导. 利用MAPK抗体进行免疫沉淀试验与体外激酶分析也表明CHN诱导的42 kD与39 kD蛋白为一类MAPK. PD98059还可以抑制CHN诱导的鲨烯合成酶与鲨烯环氧酶基因(gss与gse)的转录、β-香树素合成酶(β-amyrin synthase, β-AS)的累积与人参皂苷的合成. 这些结果表明, CHN诱导的MAPK对于促进人参皂苷的合成是必需的. EGTA与LaCl3可以抑制CHN诱导的42与39 kD MAPK活性, 钌红(ruthenium red, RR)可以抑制CHN诱导的39 kD MAPK活性, 而且它们又都能抑制人参皂苷的合成, 说明胞内钙离子浓度的升高对于诱导MAPK活性与人参皂苷的合成是必需的. PD98059可以抑制CHN诱导的氧迸发(包括质膜NADPH氧化酶活性与H₂O₂的产生), 但是二碘基苯(diphenylene iodonium, DPI)、二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)与2, 5-二羟基肉桂酸甲酯(2, 5-dihydroxycinnamic acid methyl ester, DHC)却不能抑制CHN诱导的MAPK活 性, 表明CHN诱导的MAPK活性可能作用于人参细胞氧迸发的上游.     

水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能

利用PCR方法从水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv. oryzae和pv. oryzicola)的12个菌株中, 扩增出了编码诱导植物过敏反应蛋白激发子Harpin的3类hrfA (hypersensitive response functioning factor A)同源基因hrf1, hrf2和hrf3. 同源性分析表明, 这些同源基因推测的编码产物均富含甘氨酸, 缺乏酪氨酸, 在序列的第45位附近的氨基酸都有一个半胱氨酸. Harpin_Xoo由来源于水稻白叶枯病菌的hrfA基因编码, 产物包括两类, 一类代表菌株为JxoⅢ, 其中GGG-GG基序的重复数为3个, 分子量为15.6 kD; 另一类代表菌株为Pxo112, 产物中GGG-GG基序的重复数为4个, 分子量为15.9 kD, 这两个基因分别命名为hrf1和hrf3. Harpin_Xooc由来源于水稻条斑病细菌的hrfA基因编码, 代表菌株为RS105, 其中GGG-GG重复数为2个, 分子量为15.3 kD, 水稻黄单胞菌Harpin分子中的一个半胱氨酸残基是其特有的. 将这3类基因与已报道的hpa1和xop1基因编码的氨基酸序列进行聚类分析, 结果可以将其分为4类, 来源于水稻黄单胞菌的Harpin_Xoo和Harpin_Xooc被分在相邻的两类中. 对3种产物进行比较研究结果, 在相同条件下3个代表菌株JxoⅢ, RS105和Pxo112的hrfA基因(hrf1, hrf2和hrf3)表达蛋白的相对浓度分别为: 0.389, 0.530, 0.083 mg/mL. hrf1, hrf2和hrf3在大肠杆菌(Bl21)中的表达产物(Harpins)在烟草上均能激发过敏反应和诱导抗病性, 其生物活性依次为Hrf2, Hrf1和Hrf3.     

白细胞膜色谱模型建立与白术中TLR4受体拮抗活性成分筛选研究

筛选发现白术中能够作用于TLR₄受体并具有抑制炎症反应的活性成分. 用硅胶为载体, 制备兔白细胞膜色谱固定相, 建立白细胞膜色谱模型; 以紫杉醇为模型分子, 筛选白术中作用于白细胞膜及膜受体(如TLR₄)的活性成分, 通过置换实验确定活性成分可能的作用靶点; 用整体药理实验验证活性成分的抗炎作用. 结果发现: 白术中白术内酯Ⅰ具有与紫杉醇类似的保留特性, 作用于白细胞膜及TLR₄受体, 其较强的抗炎活性与拮抗TLR₄受体有关. 所以, 本文所建立的白细胞膜色谱模型可以在体外模拟活性成分与白细胞膜及膜受体相互作用, 可用于特定靶标的作用成分和作用特性筛选研究.     

新型蛋白质修饰剂的合成及修饰牛血红蛋白的初步研究

以L-谷氨酸和己二酸为原料合成了一种新型的四官能团蛋白质修饰剂,并用核磁共振和红外光谱对其结构进行了表征。然后以其为修饰剂,对牛血红蛋白的化学修饰进行了初步的研究,并通过高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和血氧分析仪对交联牛血红蛋白的分子量和携氧性能进行了表征。结果表明,该修饰剂可以使牛血红蛋白同时在分子内和分子间发生化学交联,并较好地保持携氧能力（P50:21.7mmHg,Hill系数:2.01）,因此在众多用于开发人工血液代用品的化学修饰剂中该修饰剂具有良好的应用前景。     

照射后HeLa细胞对CDDP诱导的DNA交联产生抗性

应用EB荧光分析法测定了人宫颈癌上皮细胞系(HeLa line)经单次 ⁶⁰Co照射后顺铂(CDDP)诱导的DNA链内交联反应(ct％).经研究发现,1～6 Gy照射后,细胞相对生长分数(fraction of control growth,FCG) 减小,单位细胞DNA含量增高,HeLa细胞与CDDP的交联反应明显降低,且与照射剂量呈依赖关系.结果提示,γ射线照射后存活的肿瘤细胞可能对CDDP或烷化剂的化学治疗作用产生抗性.     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。     

心磷脂对重建Fo的质子转运高活性是必需的

从猪心线粒体纯化了F_oF₁-ATPase的膜部分质子通道F_o,SDS-PAGE表明纯度约85%,且不含F₁-ATPase的各亚基.将纯化的F_o在含不同纯磷脂组分的脂质体上重建,分别测定心磷脂(CL)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)等酸性磷脂对重建F_o质子转运活性的影响,结果表明,它们促进重建F_o质子转运活性的强弱顺序是CL＞PA＞＞ PI,而PS却完全抑制重建F_o的质子转运.阿霉素(ADM)显著抑制含CL的重建F_o的质子转运活性,提示CL明显促进F_o的质子转运可能与其具有强烈的形成非双层脂结构的倾向性相关.测定磷脂酰乙醇胺(PE)及二顺油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二反油酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)对重建F_o质子转运活性的影响表明,有形成非双层脂结构倾向性的PE,DOPE明显促进重建F_o的质子转运.荧光猝灭剂HB对重建F_o的内源荧光猝灭及专一性标记蛋白质巯基的荧光探剂acrylodan的荧光光谱分析进一步表明,适当浓度的CL可能使重建F_o具有适合的构象,并表现高的质子转运活性.     

用α1D受体高表达细胞膜色谱研究9种配体的生物亲和作用

为了增加细胞膜色谱法的选择性和特异性, 用受体高表达细胞膜色谱法研究9种α₁-肾上腺素受体配体与α_1D-肾上腺素受体亚型(α_1D-AR)的生物亲和作用. 培养稳定表达α_1D-AR的HEK293细胞株, 制备细胞膜固定相, 应用受体高表达细胞膜色谱法研究不同配体与α_1D-AR的结合情况. 结果表明: 9种不同的α₁-肾上腺素受体配体与大鼠α_1D-AR的亲和顺序为: 哌唑嗪, BMY7378, 酚妥拉明, 羟甲唑啉, 5-甲基乌拉地尔, 去甲肾上腺素, 苯肾上腺素, 甲氧明, RS-17053. 受体高表达细胞膜色谱法是一种特异、可靠的生物亲和色谱方法, 可用于α_1D-AR亚型选择性药物的高效筛选.     

色素置换影响紫细菌601光合反应中心的电化学性质及其机理

运用色素置换、单分子复合膜技术及方波伏安法测定, 研究了色素置换对紫细菌Rhodobacter sphaeroides 601光合反应中心电化学性质的影响, 并探讨了相关机理. 研究发现, 紫细菌光反应中心在外加电位驱动下也可以产生电荷分离, 其效果等同于照光条件下的原初光化学反应. 在金电极表面上, 由2,3-二巯基丁二酸(DMSA)、聚二甲基二丙烯氯化铵(PDDA)与紫细菌光合反应中心(RC)组装而成单分子层复合膜(RC-PDDA-DMSA膜). 利用方波伏安法对RC-PDDA-DMSA膜进行了研究, 用低频率和高频率方波分别检测到紫细菌反应中心光化学反应不同的4个氧化还原电位对的参数. 通过非线性拟合, 获得了P/P⁺的标准电位(0.522 V)和电极反应速率常数(13.04 s^-1). 植物去镁叶绿素(Phe)置换细菌去镁叶绿素(Bphe)后反应中心在- 0.02 V的氧化还原峰显著变化, 进一步分析后认为是色素置换降低了Bphe^- / Bphe(Phe^- / Phe)和Q_A^-/Q_A电位对之间电子转移速率. 分析不同色素置换后的光谱及电化学性质, 并对不同的色素分子的功能基团进行比较, 结果表明, 叶绿醇尾同卟啉环上的其他取代基团一样明显影响了色素置换的位点和效率.     

荧光素酶研究进展*

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg²⁺、ATP、O₂ 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =550～580nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH₂ 和O₂ 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶     

番茄果实中焦磷酸:D-果糖-6-磷酸 1-磷酸转移酶的两种酶型的分离纯化及其特性

用快速蛋白液相层析仪(FPLC)Mono Q柱(HR5/5)分离纯化成熟绿番茄果实中PFP的两种分子酶型及其特性。一种酶型为Q_1,是含两个β-亚基(60kD)的二聚体,比活为5μmol min~(-1) mg~(-1);另一种为Q_2,由四个α-亚基(66kD)和四个β-亚基(60kD)组成八聚体,比活为70.5μmol/min~(-1)·mg~(-1)。Q_1的分子量是120kD,Q_2的分子量介于500kD和530kD之间。用纯化的Q_2制备的抗血清专一地与Q_2起沉淀反应。PFP酶液贮存后,其Q_1/Q_2蛋白量比值增加明显,表明部分Q_2转化为Q_1。Q_1具有催化活力表明PFP的活性中心位于β-亚基。α-亚基可能借增强PFP酶对F2,6P_2的亲和力以提高酶的比活而起调节功能,但是Q_1的活力依赖于F2,6P_2的激活,表明β-亚基处也可能存在F_2,_6P_2的调节位点。Q_2含紧密结合的F2,6P_2分子,并表现出对F2,6P2_的不敏感性,基于此种现象,有必要重新认识PFP对F2,6P_2敏感性的内在实质。     

臭氧浓度升高对油松抗氧化系统活性的影响

以生长在开顶箱内的油松为试材,对高浓度臭氧(80 nmol·mol^-1)条件下油松(Pinus tabulaeformis)针叶中超氧阴离子自由基(O₂^·)产生速率、过氧化氢(H₂O₂)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶活性与抗坏血酸(ASA)含量进行测定.结果表明:高浓度臭氧使O₂^·产生速率提高,H₂O₂ 和MDA含量增加.ASA含量与SOD、抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶活性在高浓度臭氧熏蒸的前期升高,随后下降并低于对照.说明生长季前期,油松抗氧化系统对高浓度臭氧存在适应性反应,但不能抵抗长期臭氧胁迫带来的氧化伤害.