马齿苋叶片PEP羧化酶的分子特性

马齿苋叶片PEPCase由四个相同的亚基组成,亚基分子量为83kD。远紫外CD光谱分析表明,此酶含有36.6％α—螺旋结构。马齿苋叶片PEPCase可被G6P激活,但不能被Gly、Ser激活。G6P可防止酶的尿素变性和枯草杆菌蛋白酶的作用。这种保护效应与G6P诱导的酶构象变化有关。 从酶对低温、高温及尿素的反应来看,马齿苋叶片PEPCase的稳定性高于高粱叶片PEP—Case,两者的免疫特性和电泳特性亦不同。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的可逆胍变性

纯化的高梁叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)经不同浓度的盐酸胍处理变性失活后,在试验的蛋白浓度范围内,它的失活时间进程的动力学分析表明为一级反应。0.4 M盐酸胍处理25分钟后(O℃),酶的催化活性完全丧失,酶蛋白的远紫外圆二色性光谱、内源荧光光谱及免疫特异性等测定均表明酶的结构发生了深刻变化。甘油及PEP羧化酶的变构效应剂G6P和甘氨酸对酶在盐酸胍溶液中的变性作用有一定的保护效果。变性酶用复性缓冲液稀释20倍后,在最佳条件下,再经30分钟保温,酶的催化活性能恢复70％以上。G6P和甘氨酸能促进变性酶的复性,甘油亦有明显效果。随着酶活性的恢复,它的远紫外圆二色性、内源荧光及免疫特异性也随之恢复,变性酶的复性速率在常温下(25℃)比在低温下(0℃)要快得多。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅱ.高粱叶片PEP羧化酶的代谢物调节特性和油酸抑制效应

本文报导高粱叶片的PEP羧化酶与一些代谢物相互作用的动力学特性。MgCl_2对不同PEP羧化酶同工酶表现程度不同的负协同性,Hill系数分别为0`86(PC Ⅰ)和0.47(PCⅡ)。PEP的饱和曲线呈S型。Hill系数为2.4,表现为正协同性。在不同浓度的G6P存在下,曲线的S型特性消失,Hill系数下降至1。而在不同浓度甘氨酸存在下负协同程度逐步增强,Hill系数为0.72。测定不同浓度G6P对酶活化程度的影响结果表明高浓度G6P(10 mM以上)活化程度反而下降,同时加入低浓度的甘氨酸(0.1～5 mM)能减缓高浓度G6P活化作用下降的程度。上述结果表明Mg~( )和PEP不仅作为底物或辅因子参与反应而且以同位协同的方式调节酶构象的变化,G6P和gly活化酶的作用类型是不同的。低浓度油酸(5～50 μM)对酶有强烈的抑制效应。高浓度Mg~( )不能解除其对酶的抑制。不同材料的酶对油酸反应不同。使高梁叶片PC Ⅰ活性完全抑制的油酸浓度(100 μM),对PCⅡ和小麦的PEP羧化酶活性几乎没有多大影响,表明油酸对高梁光合型PEP羧化酶的选择性抑制与Mg~( )的螯合作用无关。酶先后与Mg~( )或油酸预保温试验结果表明油酸可能作用于Mg~( )在酶蛋白上的调节位置。     

光/暗对玉米叶片果糖-6-磷酸激酶-2和果糖-2,6-二磷酸酯酶活力的影响

比较了照光和黑暗条件下玉米叶片果糖—6—磷酸激酶—2(PFK-2)和果糖—2,6—二磷酸酯酶(FBPase-2)的活力变化。当玉米植株从暗中转入光下后,其叶片PFK—2的活力随光照时间的延长而逐渐降低,而FBPase-2活力变化不明显;从光下转入暗后叶片PFK-2活力明显上升,FBPase-2活力仍无明显变化;其PFK-2/FBPase-2比值在光处理时下降,暗处理时上升。同时叶片中果糖—2,6—二磷酸的含量与PFK-2/FBPase-2活力比值的变化趋势一致。连续光照 20 h,PFK-2活力持续下降,表明PFK-2的光钝化现象与玉米植株的昼夜节律变化无关。     

果糖-2,6-二磷酸对番茄果实PFP酶活化效应的巯基依赖性

在无二硫苏糖醇(DTT)存在下得到部份纯化的氧化型PFP酶,在广泛的pH范围内(pH6.0～9.0)失去其大部分对果糖2,6-二磷酸的敏感性。活化效应可藉与DTT保温得到恢复而不改变其最适pH值。在与DTT保温过程中,酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力逐步增加。氧化型酶的K_a值(对果糖2,6-二磷酸)在酶与DTT保温(pH8)1h之后从1400nmol/L下降到约50nmol/L。 在DTT存在下纯化的酶(还原型)经低浓度5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)处理,在使酶活性迅速失活的同时引起酶对果糖2,6-二磷酸脱敏。这一过程可为DTT处理所回复。从小麦胚中纯化的硫氧还蛋白h在恢复酶活性和酶的果糖2,6-二磷酸敏感性的效应中表明,细胞内的氧化还原状态可能藉以改变酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力而调节PFP酶的活性。     

代谢专业会议报导

这次植物代谢讨论会上共有20位同志作了报告,包括综合评论和研究论文共31篇。吕忠恕先生介绍了国外果实成熟与呼吸代谢的进展,李明启先生介绍了绿色光合细胞的呼吸代谢的进展。研究论文包括: 1.酶的活性和形成的调节(7篇)。其中有:吴相钰等报告了叶绿体中RuBP羧化酶和FDP酶体外活化受某些还原剂的调节。施教耐、吴敏贤等     

菠萝叶片中依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶的光/暗调节特性(英文)

植物中D:果糖6—磷酸1—磷酸转移酶(PPi—PFK,EG 2.7.1.90)活性的调节是非常重要的。这主要是因为它能可逆催化糖酵解和生糖两个方向的反应。光照处理菠萝叶片或离体的菠萝叶圆片使PPi—PFK的酶活性增高。与从暗处理的叶片中提取的酶的特性相比,光照处理的叶片中的酶对糖酵解方向催化活性相对增加。暗处理导致酶催化精酵解方向活性的下降。这种反映在酶活性和特性上的变化可为光照重新恢复。结果表明,菠萝叶片的PPi—PFK对体内糖酵解或生糖途径的贡献可能决定于光的状况。     

高粱和小麦叶片苹果酸酶某些特性比较

比较高粱和小麦叶片的苹果酸酶的某些特性。发现高粱苹果酸酶对NADP-是专一的,未观测到NAD-苹果酸酶的活力。高粱叶片的NADP-苹果酸酶的最适pH随底物浓度不同而异;在0.5 mM苹果酸浓度下酶的最适pH是7.0～7.5,在1 mM和10 mM浓度下最适pH各为7.5～8.0和8.0～8.5,其中以底物浓度10 mM的活性最高。小麦苹果酸酶也具有类似的效应;但与高粱相比较活性较低。两种不同来源的苹果酸酶在动力学特性上有明显的差异,小麦叶片NADP-苹果酸酶的Km(苹果酸)值1.3比高粱大3.4倍。pH、Mg~(++)、Mn~(++)和苹果酸对高粱叶片NADP-苹果酸酶活力具有不同程度的调节作用;在不同pH条件下Mg~(++)、Mn~(++)对高粱叶片NADP-苹果酸酶表现出不同程度的协同性。Mg~(++)、Mn~(++)的亲和力随pH的升高而增大。而对小麦叶片NADP-苹果酸酶活性几乎无多大影响。在我们所试验的浓度下乙酰辅酶A、甘氨酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖1-6二磷酸、琥珀酸以及延胡索酸对高粱NADP-苹果酸酶活性无影响。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅳ精氨酸残基在高粱叶片PEP羧化酶催化和调节功能中的作用

应用化学修饰的方法观察精氨酸残基在PEP羧化酶的催化和调节功能中的作用。用丁二酮在硼酸盐缓冲液存在下处理PEP羧化酶使酶活性迅速丧失。其失活速度表现为拟一级反应动力学特性。 低温处理(15℃),或者PEP、G6P、甘氨酸,苹果酸,G6P加甘氨酸和PEP加甘氨酸等酶的底物和效应剂的存在对酶的丁二酮失活均具不同程度的保护作用。PEP和G6P的P_(0.5)值各为4mM和1.5mM。 丁二酮对酶的修饰表现为可逆失活。在Tris-H_2SO_4缓冲液中透析可使被丁二酮修饰而丧失的酶活性恢复。 丁二酮处理还使酶失去对G6P的敏感性,但不影响甘氨酸对酶的调节作用。低温(15℃)下丁二酮修饰酶的G6P脱敏速度比常温下(30℃)底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度慢。比较脱敏速度常数(k_(dG6P))前者是0.0116(分~(-1)),后者是0.0562(分~(-1))。甘氨酸的加入不影响底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度而明显降低酶的丁二酮失活速度。 这些结果表明精氨酸残基不仅存在于酶的催化部位并为酶的催化所必需,同时还存在于酶的G6P结合部位而参与G6P对酶的调节功能。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅲ.高粱叶片PEP羧化酶的多构象状态

应用NEM对酶的化学修饰技术,报导了半胱氨酸残基与高粱叶片的PEP羧化酶催化功能的关系。结果表明,NEM修饰使PEP羧化酶活性丧失。酶的失活速度表现为拟一级反应动力学特性。随NEM浓度的增加酶的失活速度加快。不同效应剂对酶的NEM失活具不同影响。油酸和MgCl_2促进酶的失活,G6P、甘氨酸和苹果酸各具有不同程度的保护作用。以P_(0.5)值来比较G6P和甘氨酸的保护效果,其值各为4.17mM和3.44mM。而当这两种效应剂以等量浓度同时存在时,P_(0.5)值下降为0.06mM,表现出它们的协同保护作用。从复合效应剂对酶的热失活速度和最大反应速度(V_(max))的影响亦可看出这种协同作用的存在。上述两方面的结果表明G6P和甘氨酸同时存在时诱发的酶的构象状态与它们分别存在时诱发的构象状态各不相同。根据这些结果提出了高粱叶片的PEP羧化酶可能存在的多构象状态模型,并对其生理意义进行了讨论。