脂质体包埋猪血红蛋白的制备及其注入小鼠体内的初步试验

 为探索一条研制猪血红蛋白 (pHb)为基础的血液代用品新途径 ,开发了干膜超声法将猪血红蛋白和别构效应剂、超氧化物歧化酶等联合包埋于脂质体的技术 .考察了氢化大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 甲氧基聚乙二醇和维生素E等在制备脂质体包埋血红蛋白 (LEH)中的作用 .通过控制磷脂与其他成分的配比 ,制得包埋率为 10 3%,pHb浓度达 16 %的稳定的LEH ;进一步将pHb微囊通过小鼠尾静脉多次注入其体内 ,检测受试小鼠血液中红细胞和白细胞数、抗体滴度、血小板聚集率及肾脏组织学等方面的变化 .小鼠体内试验表明了所制备的LEH具有低免疫原性、对肾脏无明显损害等特点 .脂质体包埋pHb是一种极具开发前景的稳定的人工载氧系统     

氧化棉子糖分子内交联猪血红蛋白对其结构功能的影响

用高碘酸盐氧化法制得氧化开环棉子糖,并用它分别修饰处在氧合及脱氧构象的猪血红蛋白得到两种不同的修饰衍生物。与天然蛋白质相比,两种修饰后的猪血红蛋白衍生物均具有明显的抗α２β２四聚体解聚的特性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和反相ＨＰＬＣ分析发现这两种修饰衍生物均为分子内交联产物,而且交联都发生于２个β亚基之间,两种交联产物的紫外－可见光谱没有明显差别,但在相同浓度下,脱氧构象下被修饰蛋白质的荧光发射光强度明显     

聚乙二醇大分子化猪血红蛋白对其携氧特性的影响

用PEG共轭结合猪血红蛋白(pHb)以增大总分子量是延长它在血液循环系统中存留时间的有效方法。作为一种线性的亲水大分子,PEG对pHb的共轭会对它的携氧特性产生显著影响。研究了pHb处于不同空间构象(脱氧的T构象或氧合的R构象)、PEG修饰程度的高低、修饰用PEG的分子量的大小、有无别构效应调节剂等不同条件下PEG修饰对pHb携氧能力的影响。进而又用了PEG修饰已经用双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯(DBBF)分子内交联的pHb,考察修饰对这种内交联pHb携氧功能的影响。还比较了4种不同方法活化的PEG衍生物,对pHb修饰效率、对修饰产物携氧功能的影响及修饰产物稳定性等。本文认为,DBBF分子内交联的pHb,在有别构效应调节剂的存在下,再用PEG修饰,可以获得携氧能力好、分子量适宜、四聚体稳定的修饰产物。     

肌醇四磷酸的制备及其对猪血红蛋白的修饰

经肌醇四磷酸修饰,血红蛋白能改善氧亲和力。小麦麸皮浸出液经硫酸铵分级沉淀、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０凝胶过滤、Ｍｏｎｏ Ｑ离子交换柱梯度层析纯化得到植酸酶。用纯化的植酸酶催化植酸（肌醇六磷酸,ＩＰ６）水解,可得到一系列肌醇磷酸化合物。控制反应条件使水解终止在肌醇四磷酸（ＩＰ４）为主要产物。用国产７１４树脂填充柱一步纯化得到肌醇四磷酸钠盐,经ＨＰＬＣ反向柱,ＦＡＰ质谱分析其中不含其他肌醇磷酸化合物。     

辣根过氧化物酶同功酶C基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

无论从应用还是从理论研究角度,辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）是一种非常重要的酶．ＨＲＰ基因克隆与表达将有利于更深入研究ＨＲＰ的结构与功能．利用反转录ＰＣＲ从天然植物辣根中分离和克隆编码辣根过氧化物酶同功酶Ｃ（ＨＲＰ－Ｃ）一个ｃＤＮＡ,并测定其序列．结果发现,从基因推导出的氨基酸序列与Ｗｅｌｉｎｄｅｒ报道的辣根过氧化物酶序列有９０．６％的同源性．将该基因连接到表达载体ｐＥＴ－２４ｂ上,利用抗ＨＲＰ多克隆抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ,检测有少量目标产物表达．在诱导表达过程中,没有发现细菌生长受抑制或受明显的毒害     

右旋糖酐—吡哆醛化猪血红蛋白轭合物的氧结合特性

以５－磷酸吡哆醛修饰脱氧猪血红蛋白得到的修饰衍生物ｐＨｂβ有着较低的氧亲和力,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示该修饰没有产生血红蛋白亚基间的交联。生物相容性好的右旋糖酐经过甲苯磺酰氯活化,用来共轭结合ｐＨｂβ以增大它的分子量。轭合产物Ｄｘ－ｐＨｂβ氧亲合力较ｐＨｂβ高,但仍然低于无基质ｐＨｂ。醋酸纤维膜电泳显示Ｄｘ－ｐＨｂβ明显滞后子ｐＨｂβ,Ｄｘ－ｐＨｂβ在紫外区２３８ｎｍ处有着特征的吸收峰,并可以用来分析     

PEG和DBBF修饰猪血红蛋白及其携氧性质

采用聚乙二醇 (PEG)修饰蛋白质可以增大蛋白质的分子量 ,改善其生物相容性和在生物体内的停留时间。而小分子交联修饰则可以稳定血红蛋白的高级结构 ,改善其对组织的递氧能力。比较了 4种方法活化的PEG衍生物对猪血红蛋白的修饰效率、修饰产物的携氧功能和稳定性等。PEG的分子量、轭合PEG的数量及变构效应物的存在与否都会影响修饰产物的性质 ;考察了双 3,5二溴水杨酸延胡索酸酯 (DBBF)修饰猪血红蛋白的反应条件以及修饰产物的物理特性和携氧能力 ,并进一步采用PEG和DBBF联合修饰猪血红蛋白。结果证明 ,联合修饰产物具有稳定的四聚体结构 ,分子量达 10 70 0 0 ,半饱和氧分压P50 在 3.33kPa左右 ,接近于生理条件下人体红细胞的P50 值。