板蓝根颗粒对甲型流感病毒小鼠的作用

目的测定板蓝根颗粒抗流感病毒的药效作用。方法 A/California/7/2009（CA7）病毒滴鼻感染BALB/c小鼠观察14d,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用,计算小鼠存活率、存活天数以及延长生命率。感染的小鼠第5天每组小鼠处死一半,取肺组织,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织的保护作用。结果板蓝根可明显延长甲型H1N1流感病毒感染小鼠的存活天数并提高存活率,病理结果显示板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠的肺组织有一定程度的保护作用,与模型组比较差异显著（P〈0.05）。结论板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有较好的保护作用。     

三株交叉反应性的流感病毒HA抗体与H1N1流感病毒的致病机制分析

目的:结合临床甲型流感病例分析流感病毒可能的致病机理。方法:收集87份陕西省2009年甲型H1N1流感重症,危重症及死亡病例的血常规参数,对其淋巴细胞、红细胞和血小板三个指标分析。制备针对甲型H1N1的单克隆抗体,采用抗体亚类鉴定试剂盒分析其抗体轻链和重链的亚型,通过血凝活性实验检测三株抗体的血凝抑制活性,通过ELISA检测三株抗体与人和小鼠的血红蛋白、红细胞、白细胞膜和血小板膜的反应,通过免疫组化分析三株流感病毒抗体与正常小鼠肺组织的结合。结果:流感病毒感染后的死亡病例中淋巴细胞、红细胞和血小板均明显降低。三株抗体与人和小鼠的淋巴细胞、红细胞和血小板均有不同程度的交叉反应;免疫组化结果同时也证实三株HA抗体与小鼠的肺组织有不同的结合力。结论:流感病毒致病的原因可能与流感病毒感染机体后产生的抗体可与血液和组织中的成分结合有关。     

不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管内血栓形成

目的本实验旨在观察不同品系小鼠感染甲型流感病毒后肺组织内血栓形成的情况。方法使用H1N1病毒A/California/7/2009（CA7）株和H3N2病毒A/Brisbane/10/07株,对BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒。检测小鼠感染后肺组织病毒拷贝数并观察肺组织病理学改变。结果 H1N1和H3N2滴鼻攻毒的各组小鼠均染毒,病理表现为程度略有差异的间质性肺炎。13只H1N1病毒感染小鼠和6只H3N2感染小鼠在肺组织中观察到多个小血管内有血栓形成,血栓成分主要为纤维素和血小板。结论各品系小鼠感染H1N1和H3N2流感病毒后均可能出现肺组织内血栓形成。     

甲型H1N1流感病毒感染小鼠的发病机制

目的甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009感染BALB/c小鼠,研究甲型H1N1流感病毒病毒性肺炎发病机制。方法 4～6周龄雌性BALB/c小鼠60只,随机分为2组,实验组和对照组,每组30只。CA7流感病毒滴鼻制备甲流病毒感染小鼠模型。攻毒后第5天解剖实验和对照组小鼠,取肺组织,测定肺组织中IL-2,IL-6,TNF-α含量。结果结果实验组肺组织中IL-6,TNF-α,水平明显高于对照组,IL-2水平明显低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05）。结论 IL-6、TNF-α、IL-2这3种细胞因子在感染甲流病毒后的显著性变化与病毒感染后的肺组织病理损伤有密切的关系。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9H1N1H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1H1N1H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9H1N1H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

甲型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的研制

【目的】研制一种可同时对甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种流行亚型进行检测和分型的基因芯片。【方法】根据National Center for Biotechnology Information中Influenza Virus Resource数据库,针对H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种亚型甲型流感病毒的HA和NA基因设计46条特异性寡核苷酸探针和1条质控探针,点制成基因芯片。利用通用引物扩增流感病毒HA和NA基因,使用Klenow酶对扩增产物进行荧光标记和片段化,将标记后产物和芯片杂交,清洗、扫描后根据荧光信号判定检测结果。用18株不同种属来源的甲型流感病毒分离毒株和186份咽拭子对芯片特异性、敏感性和临床应用进行初步评价。【结果】所有18株分离毒株均能被芯片准确检测并分型,芯片检测灵敏度能达约1×104个病毒基因拷贝。同时8份咽拭子检测结果为H1N1阳性,4份咽拭子为H3N2阳性。【结论】研究表明该芯片具有较高的特异性和灵敏度,可为甲型流感病毒的监测提供一种有效的方法。     

同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法

本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。     

高灵敏焦测序结合生物发光分析仪检测甲型H1N1流感病毒

目的:建立基于核酸序列分析的快速、准确、低成本的甲型H1N1流感病毒检测方法。方法:通过优化焦测序反应体系中ATP硫酸化酶和荧光素酶的浓度,建立高灵敏的焦测序反应体系;将该体系应用于低成本、小型化的便携式生物发光分析仪,焦测序分析流感病毒M、NP、HA基因片段的核酸序列。结果:优化后的焦测序反应体系可检测低至10 fmol的DNA样本,检测灵敏度较传统焦测序提高了10倍以上。对两例样本进行检测,根据所测得的M、NP、HA基因特异性片段序列,可以确认其均为甲型H1N1感染;另外,对M2蛋白阻断剂耐药性标志位点(S31N突变)的测定结果显示该病毒存在S31N突变,为M2蛋白阻断剂耐药型。结论:高灵敏焦测序体系结合便携式生物发光分析仪成功实现了对甲型H1N1流感病毒快速、准确的低成本检测。     

流感裂解疫苗H3N2-抗H3N2免疫原性复合物滴鼻诱导小鼠黏膜免疫应答的研究

目的研究流感裂解病毒疫苗抗原抗体复合物滴鼻诱生小鼠黏膜免疫应答.方法分别以15μg H3N2、H3N2-CpG、H3N2-鼠抗H3N2及H3N2-PEG滴鼻免疫小鼠,检测肺泡灌洗液抗H3N2 IgA、血清抗H3N2 IgG效价.取免疫小鼠脾细胞,体外抗原刺激,用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液IFN-γ及IL-4分泌水平.结果H3N2-抗H3N2免疫原性复合物诱生的抗H3N2 IgA效价明显高于H3N2单独免疫组(P＜0.01),而与H3N2-CpG组无显著性差异.此外,复合物诱生的血清抗H3N2也高于H3N2单独免疫组(P＜0.05).H3N2-CpG组诱生的IFN-γ水平明显升高,而其他组之间无明显差异.结论流感病毒血凝素抗原抗体复合物、血凝素抗原加CpG佐剂可以诱生较强的局部黏膜免疫和体液免疫.这两组诱生的IgA效价均明显高于H3N2单独免疫组.另外,H3N2-CpG组小鼠的脾脏细胞经特异性抗原诱导后培养上清液中的IFN-γ水平明显升高.     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的建立H7N9禽流感病毒小鼠感染模型。方法 1×108,1×107或1×106TCID50H7N9禽流感病毒原液(A/Anhui/1/2013)滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标:临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14 d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,中性粒细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。     

基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因

建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导逆转录等温核酸扩增技术(RT-LAMP)应用于人甲型H1N1流感病毒基因检测。该技术使用对应于人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行核酸扩增反应1.5h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证。文中利用这种技术对不同来源及亚型的流感病毒进行了特异性分析,对体外转录的人甲型H1N1流感病毒HA基因RNA的系列稀释物进行了灵敏度分析,成功检测美国CDC提供的人甲型H1N1流感病毒标准品,利用RT-LAMP和RT-PCR同时检测了30份人甲型H1N1和26份季节性流感咽拭子标本。结果显示RT-LAMP方法特异性高,灵敏度可达到60个拷贝RNA分子水平,对临床标本的检出率与常规RT-PCR法相当,利用650nm的比色分析通过标准曲线可以实现对样品的定量。因此,基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增方法可用于人甲型H1N1流感病毒感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心流感监测网络实验室和哨点医院推广和应用的潜力。     

一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

本文通过比较2011年分离培养的1株季节性甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒(A/Shanghai/1167/2011(H1N1))与历年季节性甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因,追溯该病毒的基因变异与来源,探讨该毒株的出现对流感防控工作的意义.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增病毒的HA和神经氨酸酶(NA)片段,并进行测序;应用分子生物学软件对获得的序列进行分析,绘制基因进化树;同时,通过血凝抑制试验检测2011年下半年健康人群中该流感病毒的抗体水平.结果显示,A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因序列与世界卫生组织(WHO)2007～2008年季节性甲型H1N1流感病毒疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近,同源性达99.2%,与新型甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009疫苗株同源性仅为72.4%.其HA基因裂解位点为PSIQSR↓GLF,尚未出现高致病性的分子特征.HA片段共编码557个氨基酸,有9个潜在的糖基化位点,序列与2009年前WHO疫苗株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)和/Brisbane/59/2007(H1N1)相比,分别有15、12和4处不同,这些差异分布在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5和2处.该毒株在健康人群血清的抗体阳性率为34.33%,几何平均效价(GMT)为10.38.A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是2011年出现在上海地区的一个季节性甲型H1N1流感病毒毒株,其抗原变异与既往季节性甲型H1N1流感病毒相比不大,但在以A(H1N1)pdm09为主要流行株的年份检测到散在发生的既往季节性甲型H1N1流感病毒毒株应当引起重视,其在人群中的抗体水平较低,易引起流行,需要提高对类流感人群中此种毒株的持续监测.     

甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比较

目的宿主免疫系统的功能状态在病毒的感染中起着至关重要的作用,本实验观察了不同免疫缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒的差异。方法使用六个品系的近交系小鼠,经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,分析其在病毒感染后存活率、体重变化和肺组织病理改变的异同。结果感染H1N1病毒的6种小鼠在观察的14d内,野生型的C57BL／6小鼠感染开始体重缓慢下降,感染后期有所回升,有半数存活;BALB／c小鼠和四种免疫缺陷品系小鼠感染病毒后体重随病情发展快速下降,死亡率均为100％。野生型C57BL／6小鼠感染初期为较弥漫的间质性肺炎,后期病变逐渐局限;BALB／c小鼠和四种免疫缺陷品系小鼠感染病毒后出现弥漫的中重度间质性肺炎,细支气管上皮有变性坏死,但炎症细胞明显少于C57BL／6小鼠。结论在甲型H1N1流感病毒的初次感染中固有免疫和特异性免疫分别在感染的初期和后期起主要作用,宿主免疫系统的功能状态影响着甲型H1N1病毒感染和预后。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

血必净注射液干预甲型H1 N1流感重症肺炎小鼠的疗效及机制研究

目的：观察血必净注射液（血必净）治疗甲型H1 N1流感重症肺炎小鼠的疗效,并初步研究其作用机制。方法：C57BL／6小鼠随机分为正常组、模型组、血必净组,正常组小鼠予20μL PBS滴鼻,模型组小鼠2×105 TCID50／20μL甲型H1 N1流感病毒液滴鼻感染,建立流感重症肺炎小鼠模型。血必净组小鼠2×105 TCID50／20μL甲型H1 N1流感病毒液滴鼻感染,并于感染前24 h腹腔注射给药,1次／d,连续给药5 d。通过观察、检测不同时间点各组小鼠的存活率、体重、肺病毒载量、肺湿干比、肺组织病理、肺灌洗液细胞因子等结果,评价血必净干预小鼠流感重症肺炎的疗效,初步探讨其作用机制。结果：模型组小鼠存活率为30％,体重下降明显,肺湿干比明显高于正常组（P＜0．05）,提示严重肺水肿;肺组织病理显示,双肺弥漫性炎性反应细胞浸润,肺泡上皮细胞脱落、坏死,支气管上皮细胞变性,伴有水肿、瘀血、出血,提示流感重症肺炎模型成立。血必净组小鼠存活率为60％,较模型组为优,但无统计学意义（P＞0．05）,体重下降较模型组轻,肺湿干比较模型组降低,但无统计学意义（P＞0．05）;肺组织病理示炎症细胞浸润,肺脏水肿,淤血、出血等严重程度均较模型组轻,提示血必净可减轻甲型流感重症肺炎小鼠的肺损伤。模型组与血必净组肺病毒载量无统计学意义（P＞0．05）,提示血必净并无抑制病毒复制的作用。血必净组可于感染后1 d、3 d降低TNF-α水平（P＜0．05）,于感染后3 d降低IL-6水平（P＜0．05）。结论：血必净对流感重症肺炎小鼠有减轻肺损伤及死亡保护趋势,但作用不显著,这可能与血必净并无直接抗病毒,但能调节感染早期TNF-α、IL-6等细胞因子水平的作用有关。     

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本.方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同.结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景.     

基因工程α2b干扰素脂质体抗流感病毒的研究

研究基因工程α2b干扰素脂质体抗鼠肺敏感株流感病毒A/FM/1/47的作用。取9日龄SPF种蛋鸡胚随机分3组,2组实验,1组对照,按组分别接种0.2 mL干扰素、干扰素脂质体及生理盐水,35℃孵育6 h后接种EID50剂量的0.2 mL流感病毒,继续孵育72 h后取每个鸡胚的尿囊液,测血凝效价,比较抗病毒作用。然后,取小鼠随机分3组,2组实验,1组对照,按组每天滴鼻接种干扰素、干扰素脂质体及生理盐水,3 d后每组分别取一半滴鼻感染LD50剂量的流感病毒,另一半滴6 d后,滴鼻感染LD50剂量的流感病毒,比较抗病毒作用。鸡胚感染病毒组的二个实验组血凝效价均降低,干扰素组的血凝效价低于对照组,干扰素脂质体组最低。小鼠鼻腔接种干扰素组的小鼠生存情况好于对照组,干扰素脂质体组小鼠生存情况最好。干扰素脂质体有明显的抗流感病毒作用,并且干扰素脂质体组优于干扰素组。