新生与成年土拨鼠肝组织中部分差异表达的基因比较分析

目的新生土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒后,大部分发展为慢性肝炎,而成年土拨鼠感染后则多发生急性自限性肝炎。本实验目的就是寻找其肝组织中可能导致这种预后差异的关键基因。方法采用全基因组表达谱芯片技术,对比新生与成年小鼠肝组织基因表达差异,选取目的基因,再通过多个物种序列比对,设计简并引物,在土拨鼠肝组织eDNA中扩增对应基因,测序,再次设计引物,进行实时荧光定量PCR。结果与新生土拨鼠相比,成年土拨鼠肝细胞中与钙离子重吸收相关基因DNMl（Dynamin1）、DNM3（Dynamin3）及Prkcc（proteinkinaseC,gamma）表达率明显升高,分别上升2．65±0．25倍、1．90±0．34倍、2．94±0．54倍。结论在钙离子重吸收通路中,在两组小鼠肝脏中表达差异最明显的上述三个基因,在新生组与成年组土拨鼠之间也有明显差异。此类基因造成肝细胞内钙离子浓度的差别,间接影响其中肝炎病毒的复制。这种表达差异很可能是导致两个年龄段动物感染土拨鼠肝炎病毒后转归不同的原因之一。     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的人肠道病毒71型（EV71）感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症。建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础。方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10。使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测。结果与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞（rhabdomyosarcoma cell,RD细胞）的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡。病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变。病理分析发现：感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一。结论建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）核酸的荧光定量PCR（Real-time PCR）检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和表面抗原（WHsAg）的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5＇端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的建立H7N9禽流感病毒小鼠感染模型。方法 1×108,1×107或1×106TCID50H7N9禽流感病毒原液(A/Anhui/1/2013)滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标:临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14 d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,中性粒细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。     

新型H7N9病毒在同居小鼠中的传播途径

目的进一步了解新型H7N9流感病毒的致病性、传播能力以及通过何种途径进行传播。方法 H7N9病毒感染小鼠后与同居小鼠合笼,研究同居小鼠的临床变化指征、病毒复制情况、病毒在组织中的分布以及病理变化。以同居小鼠分泌物接种其他小鼠,观察同居小鼠通过何种途径传播病毒。结果 H7N9病毒可以在肺组织、肠组织和脑组织中复制,并可以在同居小鼠中传播。H7N9病毒感染小鼠其咽、眼分泌物以及粪便均具有感染性,其中尤以咽拭子的传播风险最高。结论 H7N9病毒可以不通过适应就感染小鼠,并引起小鼠间传播。被感染小鼠分泌物具有感染性。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

EV71多表位抗原亲和纯化及类病毒颗粒胞外自组装

利用肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染,有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体,采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有效分离,阻碍了对该抗原蛋白进行全面临床前活性及安全性评价。在原有融合蛋白抗原N端插入组氨酸标签,对形成的包涵体变性溶解后直接采用镍金属螯合亲和介质进行分离纯化,获得了纯度大于95%的抗原纯品,目标蛋白收率46.8%。采用透析方式脱除纯化样品中高浓度脲,发现直接透析至无脲的缓冲液中蛋白质大量沉淀,而先稀释至2mol/L脲的缓冲液中然后用G25脱盐柱完全脱除脲则无任何沉淀形成,获得近100%的蛋白质收率。透射电镜分析最终样品发现融合蛋白形成了10nm左右粒径均一的类病毒蛋白颗粒,且在p H 8.0的磷酸盐缓冲液中保持稳定。该研究结果为将EV71融合蛋白抗原发展为安全有效且低成本的手足口疫苗奠定了基础。     

人肠道病毒71型动物模型研究进展

人肠道病毒71型是婴幼儿手足口病的致病原之一,其严重的并发症可导致神经系统疾病,甚至死亡,是近期威胁中国儿童健康的因素之一。目前尚无临床疫苗可以预防该病毒感染,而EV71的动物模型是进行致病机理、疫苗评价和药物等研究的基础。本文对EV71的两种常用动物模型：小鼠和猕猴（Macaca mulatta）模型进行了描述,并对其在研究中的应用给与概括,为研究者选择合适的动物模型提供了依据。     

肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定

目的寻找肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）血清学检测用特异性抗原。方法双向电泳分离K.pneumoniae总蛋白,通过免疫印迹（Western blotting）与常见病原菌的多抗反应筛选特异性抗原蛋白,原核表达该蛋白并用ELISA法验证。结果获得K.pneumoniae的双向电泳图谱。寻找Western blotting中与K.pneumoniae自身多抗反应而不与与其它病原菌多抗反应的蛋白,质谱鉴定为酸性磷酸酶（Acid phosphatase,GI：238894261）。经表达纯化并以酶联免疫吸附试验（ELISA）验证,证明该蛋白作为包被抗原的灵敏度高,特异性强。结论 K.pneumoniae酸性磷酸酶是适用于该菌感染检测特异性抗原蛋白。