重组大肠杆菌高效分泌表达β-木糖苷酶发酵条件的优化

[目的]嗜热拟青霉β-木糖苷酶基因在大肠杆菌中高效分泌表述重组β-木糖哥酶摇瓶发酵条件优化,及5 L发酵罐放大培养.[方法]通过单因素试验对诱导剂种类及其添加量、诱导起始 OD600、培养温度、培养时间进行优化研究.[结果]摇瓶优化结果表明:2％乳糖为诱导剂、培养温度为33℃C、OD600控制在0.8-0.9时诱导为最佳产酶条件,在此条件下培养48 h后胞外酶活达到103.9 U/mL,胞外分泌的比例高达99％以上.进行5L发酵罐放大培养,发酵48 h胞外酶活达到最高值392.5 U/mL,蛋白含量为10.1 g/L.[结论]该重组大肠杆菌高效分泌β-木糖苷酶,具有较好的工业化生产前景.     

重组Bacillus subtilis产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵优化

利用本研究室已构建的重组菌Bacillus subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase对产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵产酶进行了优化,考察了培养基中重要成分:碳源、有机氮源、无机氮源、有机与无机氮源质量比、碳源与氮质量比、金属离子种类等单因素对该重组菌产α/β-CGTase的影响,并采用正交实验对发酵培养基进行优化,对优化结果分析可知,重组菌B.subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase发酵产α/β-CGTase的最优培养基成本为:葡萄糖5 g/L,氮源(鱼骨蛋白胨∶NH4Cl=3∶1)25 g/L,1 mmol/L Mg^2+。在最优条件下发酵培养,α/β-CGTase的酶活由原来TB发酵培养基的9.20 U/mL提高至20.32 U/mL,是优化前酶活的2.2倍,为α/β-环糊精葡萄糖基转移酶的工业应用提供了理论支持。     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

利用指数流加补料高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶重组大肠杆菌

【目的】对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-β-ffase进行高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶工艺研究。【方法】比较溶氧反馈补料和指数流加补料对重组菌发酵产酶的影响,对不同比生长速率和诱导时机进行优化。【结果】确定了双阶段指数流加过程中重组菌生长的比生长速率,分别控制诱导前期比生长速率为0.20 h~(-1),诱导后期比生长速率为0.13 h~(-1),诱导时机为指数中期。获得细胞干重约为51 g/L,最高酶活达到1.79×10~5 U/L,单位菌体产酶量为3 510 U/g,单位产酶速率达到3.58×10~4 U/(L·h),生物量、单位菌体产酶量和产酶速率分别是指数流加未优化前的1.8、1.7和3.0倍。【结论】双阶段指数流加补料工艺能有效提高β-呋喃果糖苷酶的产酶量,为β-呋喃果糖苷酶的进一步工业化奠定基础。     

重组酪氨酸酚裂解酶发酵工艺的研究

左旋多巴是治疗帕金森氏病的首选药物,生物酶法合成左旋多巴具有工艺简单、条件温和、立体选择性高和环境友好等优点。本论文以实验室前期构建的表达具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum) TPL (Fn-TPL)的重组大肠杆菌为基础,采用单因素实验通过对5 L发酵罐发酵工艺优化以及补料策略的研究,确定了分批发酵的工艺参数:pH 6. 5,诱导温度30℃,诱导剂乳糖20 g/L。在5 L发酵罐中,进一步研究了10 mL/h、20 mL/h、30 mL/h三个速率的恒速流加对菌体生物量和TPL酶活的影响。结果表明,补料速率为20 mL/h时,生物量最高为30. 43 g dcw/L,体积酶活最高为9 420 U/L,较摇瓶发酵培养活力提高了3. 3倍。     

补料发酵法制备β-葡萄糖苷酶的研究

研究了黑曲霉制备β-葡萄糖苷酶液态发酵过程中添加麸皮和纤维二糖的补料工艺.补料量及补料次数影响着β-葡萄糖苷酶的分泌.经过四次补加1%菌麸皮干粉,发酵液中β-葡萄糖苷酶活力由未补料的1.72 U/mL增加到5.07 U/mL,提高了近3倍.而且,添加麸皮浸提液能达到同样效果.采用分批补料工艺产酶时,初始浓度为3%的麸皮用量比较适宜,其蛋白含量和β-葡萄糖苷酶的活力均为最高,分别达到0.69nag,/mL和7.00 U/mL.在补料总量和补料次数相同的情况下,以递减方式补料效果最好,产酶达7.34 U/mL.补加纤维二糖对β-葡萄糖苷酶的分泌具有一定的诱导作用,在接种培养48h时补加0.2%纤维二糖比较适宜.研究表明,分批补料发酵有利于黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶,是一种很好的提高酶产量的方法.     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

啤酒糟固态发酵产β-葡萄糖苷酶的研究

利用啤酒糟为培养基对黑曲霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺条件进行了优化和动力学研究。单因素试验表明,最适产酶温度、料液比和接种量分别为30℃、1∶5(啤酒糟∶水,g∶mL)和10%(mL/g);利用L9(34)正交试验优化反应条件,结果表明,在25℃,初始料水比为1:5,接种量10%的条件下,培养4d,β-葡萄糖苷酶的酶活可达10.85U/g。动力学研究表明,β-葡萄糖苷酶在96h进入产酶的高峰期,120h达到酶活最大值。     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。     

海洋枯草芽孢杆菌产纤溶酶的诱变育种与发酵工艺优化*

目的:对海洋来源的具有产纤溶酶能力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LC6-1进行紫外诱变,得到高产且稳定的突变株PW6-3,对该突变株发酵产酶的条件进行优化。方法:采用单因素和正交试验进行发酵培养基组分和培养条件的优化。结果:突变株PW6-3的酶活力为(6 960.21 ± 85.51)U/mL,较原始菌株提高了30.48%。以PW6-3为出发菌株,采用单因素及正交试验的方法对菌株进行发酵培养基组分与培养条件优化,最终得到的最佳培养基组分是:玉米淀粉30 g/L,玉米浆干粉40 g/L,CaCl₂ 3 g/L;最佳发酵培养条件是:32℃,转速200 r/min,接种量3%,pH 6.5,种龄18 h,发酵培养时间66 h,最终菌株的酶活力稳定在(9 203.63 ± 67.85)U/mL。结论:发酵工艺优化后,菌株PW6-3纤溶酶产量较诱变之前的菌株LC6-1提高72.53%,且发酵工艺成本较低,具有较好的经济效益。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响, 应用正交试验优化发酵培养基组成, 结果为: 蛋白胨 60 g/L, 麦芽糖 30 g/L, MgSO4 0.5 g/L, ZnSO4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为: 装液量40 %, 发酵pH 6.5, 接种量10 %, 发酵温度30 ℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程, 最佳培养时间为25 h。     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp.strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化.研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO4 0.5 g/L,ZnSO4 0.01 g/L,KCl 1.0 g/L.优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL).摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃.考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h.     

真菌产3种β-D- Glucuronidase酶学性质

分离筛选到能代谢甘草酸并产生不同产物的3株菌株,其中Penicillium sp.Li-3转化甘草酸生成GAMG,As-pergillus sp.Li-20生成GAMG和甘草次酸,Aspergillus sp.Li-62生成甘草次酸。对这3株菌表达β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶学性质进行了研究,结果表明:Penicillium sp.Li-3、Aspergillus sp.Li-20和Aspergillus sp.Li-62β-D-葡萄糖醛酸苷酶最适催化pH分别为4.2~4.6,5.8和6.2,最适催化温度为50、45和55℃。Penicillium sp.Li-3表达的β-D-葡萄糖醛酸苷酶Km为0.328μmol/L,Vmax为0.003 5 mmol/(L.min);Aspergillus sp.Li-20β-D-葡萄糖醛酸苷酶Km为3.61 mmol/L,Vmax为0.034 mmol/(L.min);而Aspergillus sp.Li-62β-D-葡萄糖醛酸苷酶Km为0.43 mmol/L,Vmax为0.106 mmol/(L.min)。     

α-氯丙酸脱卤酶发酵条件研究

以从厌氧污泥中分离筛选获得的对α-氯丙酸有高效脱卤能力的微生物菌株W20为出发菌株,对其发酵生产脱卤酶的工艺进行了研究。其产脱卤酶培养基组成为:葡萄糖20.0 g/L,尿素1.0 g/L,酵母膏0.5 g/L,Na2HPO4.12H2O 3.2 g/L,KH2PO41.5 g/L,无水MgSO40.098 g/L,微量元素液10 mL/L,维生素溶液5.0 mL/L。产酶条件为:接种量10%,培养基初始pH7.0,培养温度30℃,装液量80 mL/250 mL摇瓶,摇床转速180 r/min。在以上获得的培养基和培养条件下培养48 h后测酶活,脱卤酶活力达到8.76 U/g干菌体,比在原始条件下提高约10倍。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

哈茨木霉产β-1,3-葡聚糖内切酶的发酵工艺条件研究

对哈茨木霉(Trichoderma harzianum GIM 3.442)产β-1,3-葡聚糖内切酶的液体发酵条件进行了单因素优化实验,确定了最佳培养基成分和培养条件,在此基础上通过正交试验设计对复合碳源(葡萄糖、茯苓多糖)、胰蛋白胨、Na NO3和磷酸盐进行了L9(34)试验,研究了4种因素对哈茨木霉产酶的影响,确定了最佳培养条件:葡萄糖42.0 g/L,茯苓多糖18.0 g/L,胰蛋白胨15.0 g/L,Na NO35.0 g/L,初始p H 6.0,接种量8%,28℃,110 r/min培养6 d。优化后总酶活Etotal和β-1,3-葡聚糖内切酶Eendo活力达到了471.6 U/m L和327.4 U/m L,比优化前分别提高了7.3倍和23倍,且内切酶占总酶活的比例Eendo/Etotal由0.24增加到0.71,效果显著。     

离子液[Bmim]Br中β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸选择性水解

甘草酸可被β-葡萄糖醛酸苷酶选择性地催化水解为单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),GAMG具有较甘草酸更显著的抗癌、抗炎等药理作用。对5种不同溶剂体系中β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸的选择性水解反应进行考察,并对离子液的浓度、底物浓度、反应温度和反应时间对产率的影响进行探讨,旨在提高GAMG的产率,更好地应用于医药及工业生产。结果表明,在离子液([Bmim]Br)体系中,甘草酸水解生成GAMG的产率高达99.6%,比常用磷酸缓冲液体系中高10%,且副产物少。在离子液浓度为0.01 mol/L～0.06 mol/L范围内,GAMG产率与离子液浓度呈线性关系,当[Bmim]Br浓度为0.06 mol/L,反应温度为45℃时,反应5 h,甘草酸可被完全转化生成GAMG。离子液[Bmim]Br可提高β-葡萄糖醛酸苷酶的稳定性,可作为友好溶剂应用于甘草酸的选择性催化水解制备GAMG。     

响应面法优化黑曲霉HDF05产β-葡萄糖苷酶过程参数

为获得黑曲霉Aspergillus niger HDF05菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,对其发酵条件进行了优化。采用Plackett-Burman实验设计考察关键发酵操作参数对产酶的影响。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对4个显著性因素进行分析。Plackett-Burman实验结果表明,发酵温度、装液量、麦麸和 (NH4)2SO4浓度对β-葡萄糖苷酶合成影响显著。通过响应面分析得到一元二阶方程,对方程求解得到优化的发酵过程参数：发酵温度为28 ℃,装液量为71.4 mL/250 mL,麸皮浓度为36 g/L,(NH4)2SO4浓度为5.5 g/L。采用该优化的过程参数,菌株的最大产β-葡萄糖苷酶活力可达60.06 U/mL,较优化前提高了23.9％。将黑曲霉HDF05产生的β-葡萄糖苷酶用于酸解玉米芯纤维残渣的酶解实验中,可明显降低纤维二糖的积累,48 h内可使玉米芯纤维素残渣酶解得率达到80.4％。     

重组有机磷水解酶MPH的发酵条件的优化研究

有机磷水解酶在去除有机磷农药残留中具有重要的应用前景。在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了有机磷水解酶(MPH)的重组诱导表达之后,为了实现工业化生产MPH,考察了以乳糖为诱导剂,碳源、氮源、金属离子、培养温度、乳糖浓度及诱导时间等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(34)正交实验进一步确定了最佳的碳源、氮源及乳糖浓度。在此基础上利用7L自控发酵罐进行了发酵过程研究,经12h培养,得到菌体12.65g(DCW)/L,MPH表达量为14.56%,酶活18.69I U/mL。