GST-His-Heparinase Ⅰ双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pET15b-HepⅠ为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepⅠ基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX-His-HepⅠ转入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrap FF和HisTrap HP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS-PAGE检测,在66 kDa和43 kDa处显示特异条带,分别与GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白预期分子量相符;最终His-HepⅠ融合蛋白的比酶活为86.45 IU/mg,纯度高达99%,与仅一步亲和纯化得到的GST-His-HepⅠ融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepⅠ提供了一种方法,对制备高安全性的LMwH和解析HepⅠ晶体结构具有重要意义。     

基于分段伪氨基酸组成成分特征提取方法预测蛋白质亚细胞定位

蛋白质的亚细胞定位与蛋白质的功能密切相关,其定位预测有助于人们了解蛋白质功能.文章提出一种分段伪氨基酸组成成分特征提取方法,采用支持向量机算法对Chou构建的两个蛋白质亚细胞定位数据集(C2129,CS2423)进行了分类研究,并采用总分类精度Q3、内容平衡精度指数Q9等参数评估预测分类系统性能.预测结果表明,基于分段伪氨基酸组成成分特征提取方法的预测性能,优于基于完整蛋白质序列的伪氨基酸组成成分特征提取方法.例如,基于分段矩描述子伪氨基酸组成成分特征提取方法,数据集C2129的Q3和Q9分别为84.7%和60.8%,比基于完整蛋白质序列的矩描述子伪氨基酸组成成分特征提取方法分别提高1.8和2.2个百分点,且Q3比现有Xiao等人的方法提高了9.1个百分点.基于分段伪氨基酸组成成分特征提取方法构成的特征向量不仅包含残基之间的位置信息,而且还包含蛋白质子序列之问的耦合信息,另外蛋白质分段子序列可能和蛋白质的功能域有一定的联系,从而使这一方法能够有效地预测蛋白质亚细胞定位.     

基于扩展起始节点和加权融合策略预测肺癌风险致病基因

肺癌风险致病基因预测有助于了解疾病发病机制、提高临床治疗效果.目前,以重启游走为框架的风险致病基因预测算法,普遍存在起始节点少、节点转移概率相同、信息源单一的问题.为此,本文提出一种基于扩展起始节点和加权融合策略的风险致病基因预测算法(命名为AFMFSC),并在肺癌中验证算法有效性.首先,基于增广模糊测量思想,计算疾病表型近似基因间的增广功能相似得分,从中选出重要基因与致病基因作为扩展起始节点;其次,采用节点拓扑相似度转移矩阵及基因表达差异相关性转移矩阵,分别在蛋白质网络中重启随机游走,并将两种结果加权融合排序;最后,通过富集分析排名靠前基因,得到有显著意义的风险致病基因.AFMFSC算法预测的73个肺癌风险致病基因,均与肺癌发生、发展有密切联系,生物学意义显著.与其他排序算法相比,AFMFSC算法的Top 1%、Top 5%和AUC值比较大,平均排名和受拓扑特性偏差影响程度小;融合策略排名性能优于单一转移矩阵或普通邻接矩阵游走排名.AFMFSC算法不仅能准确有效地预测肺癌风险致病基因,而且可推广预测其他疾病风险致病基因,为探索癌症致病机理提供新视角及依据.     

基于氨基酸组成分布的蛋白质同源寡聚体分类研究

基于一种新的特征提取方法——氨基酸组成分布,使用支持向量机作为成员分类器,采用“一对一”的多类分类策略,从蛋白质一级序列对四类同源寡聚体进行分类研究。结果表明,在10-CV检验下,基于氨基酸组成分布,其总分类精度和精度指数分别达到了86.22%和67.12%,比基于氨基酸组成成分的传统特征提取方法分别提高了5.74和10.03个百分点,比二肽组成成分特征提取方法分别提高了3.12和5.63个百分点,说明氨基酸组成分布对于蛋白质同源寡聚体分类是一种非常有效的特征提取方法;将氨基酸组成分布和蛋白质序列长度特征组合,其总分类精度和精度指数分别达到了86.35%和67.23%,说明蛋白质序列长度特征含有一定的空间结构信息。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

基于熵聚类和双重筛选策略挖掘动脉粥样硬化风险疾病基因(英文)

动脉粥样硬化是因脂质堆积在血管壁上并受到多种遗传和环境因素影响的一种复杂的病理生理疾病。动脉粥样硬化风险疾病基因的辨识可以增进对该疾病机理的了解,并对该疾病的诊断和治疗起到指导性作用。虽然在风险疾病基因的辨识方面已经提出了很多计算方法,但仍存在着推论准确性和计算效率方面的问题。一种命名为基于熵聚类和双重筛选(Entropy-based clustering and double screening,ECDS)的新方法被用来辨识该疾病的风险疾病基因。该方法将功能基因组信息和蛋白质相互作用网络拓扑结构信息进行整合,运用于基于熵聚类的方法中,之后,使用双重筛选策略(即支持向量机和相似性得分)进行风险疾病基因挖掘。运用该方法,从巨噬细胞样本和泡沫细胞样本中分别辨识出79个和113个风险疾病基因。该结果表明ECDS在辨识动脉粥样硬化风险疾病基因方面非常有效。此外,该方法也很易于扩展应用到其它复杂疾病的风险基因辨识中。     

重组肝素酶I热失活动力学模型的建立与应用

对组氨酸标签肝素酶I（His．HepI,Ec4．2．2．7）的热失活机制进行了研究。针对短暂低温处理可以使热失活His．HepI酶活部分恢复及添加二硫苏糖醇（D1Tr）使其热稳定性提高的现象,利用荧光探针法研究了失活过程His．HepI构象变化,证明了该酶构象存在可逆转变行为。为进一步明晰His．HepI的热失活机制,假设该酶热失活的主要途径包括去折叠及形成聚集体,并以此为基础建立模型进行拟合,模型与实验值吻合良好,表明假设的合理性。根据模型计算的活化能为Er=100．217kJ／mol、Eir=7．857kJ／mol和Ed=77．062kJ／mol,此数据从一定程度上解释了冷处理为何能使His．HepI部分恢复活性。进一步研究表明,任何能够抑制这两种途径发生的措施对于提高His．HepI热稳定性都是有效的。     

基于节点-模块置信度及局部模块度双重约束挖掘前列腺癌候选疾病模块

前列腺癌病因及发病机理研究有助于前列腺癌预防和治疗.目前,前列腺癌生化试验研究方法成本高、耗时,而基于网络计算方法容易受基因表达谱数据不完整、噪声高及实验样本数量少等约束.为此,本文提出一种基于节点-模块置信度及局部模块度的双重约束算法(命名为NMCOM),挖掘前列腺癌候选疾病模块.NMCOM算法不依赖基因表达谱数据,采用候选基因与致病表型之间一致性得分,候选基因与致病基因之间语义相似性得分融合排序策略,选取起始节点,并基于节点-模块置信度及局部模块度双重约束挖掘前列腺癌候选疾病模块.通过对挖掘出的模块进行富集分析,最终得到18个有显著意义的候选疾病基因模块.与单一打分排序方法及随机游走重开始方法相比,NMCOM融合排序策略的平均排名比小、AUC值大,且挖掘出结果明显优于其他模块挖掘算法,模块生物学意义显著.NMCOM算法不仅能准确有效地挖掘前列腺癌候选疾病模块,且可扩展挖掘其他疾病候选模块.     

GST-His-Heparinase I双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pETl5b-Hep I为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepI基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX．His．HepI转入E．coliBL21（DE3）感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrapFF和HisTrapHP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS—PAGE检测,在66kDa和43kDa处显示特异条带,分别与GST．His．HepI和His-HepI融合蛋白预期分子量相符;最终His—HepI融合蛋白的比酶活为86．45IU／mg,纯度高达99％,与仅一步亲和纯化得到的GST．His—Hep I融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepI提供了一种方法,对制备高安全性的LMWH和解析HepI晶体结构具有重要意义。