响应面法优化黑曲霉HDF05产β-葡萄糖苷酶过程参数

为获得黑曲霉Aspergillus niger HDF05菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,对其发酵条件进行了优化。采用Plackett-Burman实验设计考察关键发酵操作参数对产酶的影响。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对4个显著性因素进行分析。Plackett-Burman实验结果表明,发酵温度、装液量、麦麸和 (NH4)2SO4浓度对β-葡萄糖苷酶合成影响显著。通过响应面分析得到一元二阶方程,对方程求解得到优化的发酵过程参数：发酵温度为28 ℃,装液量为71.4 mL/250 mL,麸皮浓度为36 g/L,(NH4)2SO4浓度为5.5 g/L。采用该优化的过程参数,菌株的最大产β-葡萄糖苷酶活力可达60.06 U/mL,较优化前提高了23.9％。将黑曲霉HDF05产生的β-葡萄糖苷酶用于酸解玉米芯纤维残渣的酶解实验中,可明显降低纤维二糖的积累,48 h内可使玉米芯纤维素残渣酶解得率达到80.4％。     

微生物堆肥技术修复石油污染土壤的试验研究

目的利用堆肥处理技术对大庆油田原油污染土壤进行生物修复处理研究,建立最佳堆制配比及堆制条件。方法比较堆肥过程中不同碳氮比对石油烃降解效果的影响,分析堆制过程中各理化参数和总石油烃降解的变化趋势,建立最佳堆制配比及堆制条件。结果 3种比例的堆肥处理,总碳含量呈下降趋势而总氮含量呈上升趋势,当C∶N约为30∶1时,堆肥温度9d持续在50℃以上,土壤中石油烃降解率达到最高。60d后,土壤中总石油烃的降解率可达78%。结论堆肥C∶N为30∶1时为最佳的堆制比例。     

三种土壤微生物总DNA提取方法的比较

本文对3种常用的土壤微生物总DNA提取方法Martin法、高盐改进法及试剂盒法进行了比较,并通过DNA得率、纯度及16S rDNA V3可变区的PCR扩增结合DGGE法(denaturing gradient gel electrophoresis),分别对3种方法进行评价.结果表明,3种方法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求.其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA得率较低且成本昂贵.Martin法和高盐改进法用时较长,DNA得率较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉.     

长期施肥对农田黑土微生物群落功能多样性的影响

为了研究长期不同施肥对农田黑土微生物群落功能多样性的影响,采用Biolog ECO微平板培养法,对已经连续施肥35年的农业部哈尔滨黑土生态环境重点野外科学观测试验站4种处理(CK、NPK、M、MNPK)的两个土层(0～20、20～40 cm)微生物群落功能多样性进行研究.结果表明: 在0～20 cm土层,有机无机肥(MNPK)配施能够显著提高土壤微生物对碳源的利用能力以及群落代谢功能的丰富度、多样性和优势度,而在20～40 cm土层则低于单施化肥(NPK)处理,两个土层单施化肥均降低土壤微生物群落代谢均匀度.不同施肥处理土壤微生物对6种碳源的利用率在0～20和20～40 cm两个土层间存在差异,而在每个土层的处理间差异显著(P<0.05),但各处理间的变化规律在两个土层中不一致.典范对应分析(CCA)结果表明,各处理土壤微生物群落代谢功能在0～20和20～40 cm土层间存在差异,且在两个土层的处理间也存在差异,而土壤养分含量对各处理土壤微生物群落代谢功能的影响规律在两个土层中较为相似.长期不同施肥会对耕层及以下土壤微生物群落功能多样性产生影响,在20～40 cm土层中单施化肥对微生物群落功能多样性的影响较大.     

大豆疫霉根腐病菌的rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增了大豆疫霉根腐病菌具有差异的17个菌株的ITSI与ITS2,经过与DL2000的标准分子量DNA进行比较,得到了大约800~1000bp左右的片段,并对PCR产物进行了序列测定。以USA为外类群利用最大简约法构建了大豆疫霉根腐病菌的系统发生树,并分析了菌株之间的遗传进化关系。结果表明:不同菌株ITS1和ITS2在碱基构成上有很大差异,17个菌株大致分为4个谱系中,且来自于同一地区的菌株大都分布在同一谱系中,显示出地理上的差异。     

鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建

鸡胚成纤维细胞(CEF)是研究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要细胞材料,而构建CEF的cDNA表达文库是筛选IBDV在CEF中的细胞受体,研究细胞嗜性的基础平台。采用Gateway技术构建CEF的表达文库,避免使用限制性内切酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。该技术将CEF的mRNA分离纯化后,以5′端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接Adapter,层析柱纯化,通过BP重组反应构建cDNA入门文库,其平均滴度为1.1×106cfu/mL,文库总容量为1.2×107cfu,平均插入片段为2243bp,重组率为100%。通过LR重组反应将入门文库转换为表达文库,经测定平均滴度为5×105cfu/mL,文库总容量为5.5×106cfu,平均插入片段为2411bp,重组率为100%。结果表明,所构建的文库具有较高的重组率和较大的库容量,可作为较高质量的文库来研究IBDV的相关基因,为研究病毒受体和病毒入侵途径,进一步了解IBDV的致病机理奠定了基础。     

桔青霉木聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达及活性分析

通过同源序列PCR克隆的方法,获得桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2菌株的木聚糖酶编码基因xyl,该基因全长984 bp,编码327个氨基酸,无内含子序列,具有完整开放阅读框。其编码的氨基酸序列N端具有一段包含19个氨基酸的信号肽序列,并具有糖基水解酶第10家族(GH10)的保守催化域特征,推测该酶属于第10家族成员。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9相连接构建重组载体pPIC9-XYL,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中。挑选阳性重组子经测序、酶活性以及SDS电泳分析表明,xyl基因成功在毕赤酵母中分泌表达,重组酶活性可达214.15 IU/mL。该重组酶最适温度与最适pH分别为50℃和4.5,且具有良好的pH和热稳定性。     

木耳菌丝老化过程的微形态学研究

分别从显微和超微结构观察木耳菌种老化过程中菌丝细胞的形态变化。结果显示：接种后30d时,光镜下观察到菌丝结构均匀紧凑,细胞壁光滑;电镜下观察到细胞结构完整,内含物丰富,各种细胞器形态规整,没有老化现象。接种后60d时,光镜下菌丝部分肿胀,色泽加深;电镜下细胞壁疏松,线粒体和液泡肿大,细胞核不规则肿胀,核仁消失,脂肪滴和囊泡增多,并有少量电子致密度高的嗜锇性黑色颗粒状物质出现,表明菌丝开始老化。90d时,光镜下部分菌丝严重肿胀,且色泽更深;电镜下线粒体和液泡肿胀明显,部分细胞核破裂,脂肪滴、囊泡和电子致密度高的嗜锇性黑色颗粒状物质显著增多,细胞壁更加疏松。120d时,光镜下许多菌丝开始断裂,色泽进一步加深;电镜下细胞壁塌陷,膜系统也随之解体,线粒体等细胞器部分溶解消失。150d时,光镜下大部分菌丝完全断裂,并失去菌丝形态;电镜下细胞膜及其内含物已基本消失,只剩部分严重塌陷的细胞壁残骸。由此表明,木耳菌丝的老化是一个由个别向整体逐渐过渡的不可逆的过程。     

静态好氧高温牛粪堆肥中nirK型反硝化细菌群落动态变化

【背景】堆肥过程中,不同反硝化微生物相互作用产生大量气态氮,不仅导致氮素流失使得堆肥肥效降低,而且造成环境污染。但是目前关于堆肥中反硝化细菌群落结构变化,尤其是群落结构与堆肥理化因子间相关性方面的报道较为欠缺。【目的】对堆肥中反硝化细菌进行研究,旨在揭示反硝化细菌群落动态变化,为深入理解堆肥氮循环机理提供科学数据。【方法】设计一种静态好氧高温堆肥技术处理牛粪和水稻秸秆,利用高通量测序技术研究堆肥中nirK型反硝化细菌群落组成的动态变化,并分析优势反硝化细菌菌属与理化指标之间的相关性。【结果】堆肥全程共17d,各项堆肥理化指标以及生物学指标表明堆肥已经基本腐熟。高通量测序结果表明,在堆肥的不同阶段nirK型反硝化细菌群落结构差异显著。门水平上,堆肥中反硝化细菌属于变形菌门(Proteobacteria)和一未分类门;目水平上,优势类群主要属于根瘤菌目(Rhizobiales)、红杆菌目(Rhodobacterales)和伯克氏菌目(Burkholderiales),其中根瘤菌目(Rhizobiales)的种类最多,而伯克氏菌目(Burkholderiales)的相对丰度最高。Spearman相关性分析表明未分类门的反硝化细菌和未分类科根瘤菌目的反硝化细菌与全碳、碳氮比、含水率以及pH呈显著负相关(P0.05),与凯氏氮和硝态氮呈显著正相关(P0.05);其他优势菌属与全碳、碳氮比、含水率以及pH呈显著正相关(P0.05),与凯氏氮和硝态氮呈显著负相关(P0.05);未分类科伯克氏菌目的反硝化细菌、未分类纲变形菌门的反硝化细菌、产碱杆菌科的Pusillimonas属和副球菌属(Paracoccus)与铵态氮显著相关(P0.05)。【结论】静态好氧高温堆肥技术可以缩短堆肥周期。在堆肥的不同阶段nirK型反硝化细菌群落结构差异显著,并且该菌群落结构的变化受到堆肥理化因子的显著影响。本研究有助于揭示堆肥中氮素转化规律,并为改进堆肥工艺提供理论依据。     

11个灵芝菌株的分子ID构建

[目的]收集11株灵芝菌种为材料,在分子水平上对其进行分类鉴定,并构建分子ID.[方法]采用ITS和SSR分子标记技术,对11株灵芝进行分子鉴定分析.[结果]通过内转录间隔区(ITS)序列测定分析表明,与GenBank上登录的灵芝(Ganoderma lucidum)菌株ITS序列相似度达到99％,在种的水平上证明实验所采用的供试菌株均属灵芝种(Ganoderma lucidum).利用SSR分子标记技术对菌株进行引物扩增,综合多态性条带,用NTSYS软件进行聚类分析,相似度在0.62水平上,1 1个灵芝菌种被分成4个类群,其中GL-2与GL-4各自聚为一类.用ID Analysis 1.0软件进行数据分析表明,用5对SSR引物可将11株灵芝供试菌种完全区分开,并构建其分子身份证.[结论]基于SSR分子标记构建灵芝菌属的分子ID是可行的.