GST-His-Heparinase Ⅰ双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pET15b-HepⅠ为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepⅠ基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX-His-HepⅠ转入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrap FF和HisTrap HP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS-PAGE检测,在66 kDa和43 kDa处显示特异条带,分别与GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白预期分子量相符;最终His-HepⅠ融合蛋白的比酶活为86.45 IU/mg,纯度高达99%,与仅一步亲和纯化得到的GST-His-HepⅠ融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepⅠ提供了一种方法,对制备高安全性的LMwH和解析HepⅠ晶体结构具有重要意义。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

重组肝素酶I热失活动力学模型的建立与应用

对组氨酸标签肝素酶I（His．HepI,Ec4．2．2．7）的热失活机制进行了研究。针对短暂低温处理可以使热失活His．HepI酶活部分恢复及添加二硫苏糖醇（D1Tr）使其热稳定性提高的现象,利用荧光探针法研究了失活过程His．HepI构象变化,证明了该酶构象存在可逆转变行为。为进一步明晰His．HepI的热失活机制,假设该酶热失活的主要途径包括去折叠及形成聚集体,并以此为基础建立模型进行拟合,模型与实验值吻合良好,表明假设的合理性。根据模型计算的活化能为Er=100．217kJ／mol、Eir=7．857kJ／mol和Ed=77．062kJ／mol,此数据从一定程度上解释了冷处理为何能使His．HepI部分恢复活性。进一步研究表明,任何能够抑制这两种途径发生的措施对于提高His．HepI热稳定性都是有效的。     

GST-His-Heparinase I双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pETl5b-Hep I为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepI基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX．His．HepI转入E．coliBL21（DE3）感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrapFF和HisTrapHP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS—PAGE检测,在66kDa和43kDa处显示特异条带,分别与GST．His．HepI和His-HepI融合蛋白预期分子量相符;最终His—HepI融合蛋白的比酶活为86．45IU／mg,纯度高达99％,与仅一步亲和纯化得到的GST．His—Hep I融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepI提供了一种方法,对制备高安全性的LMWH和解析HepI晶体结构具有重要意义。