嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶在大肠杆菌中的活性表达与分泌调控

[目的]从长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)JNB-1中克隆出普鲁兰酶基因并在大肠杆菌系统中表达,通过优化诱导条件和使用化学添加剂提高了胞外酶活.[方法]采用PCR方法,从B.naganoensis基因组中扩增出普鲁兰酶基因pul,构建重组菌E,coli BL21/pET-20b-pul.通过优化,确定优化后的IPTG诱导条件以及甘氨酸、Na+的最佳添加参数.[结果]普鲁兰酶在大肠杆菌中得到有效表达,其相对分子质量为ll9kDa.在优化后的诱导条件(诱导温度20℃,IPTG终浓度0.4 mmol/L,在菌体OD600至1.2时诱导)下,普鲁兰酶的总酶活达到10.8 U/mL.添加甘氨酸和Na+均能有效促进普鲁兰酶的分泌.在诱导时添加终浓度0.08 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L Na+,胞外酶活提高至8.1 U/mL,是不加任何添加剂的10.3倍.[结论]该重组菌的构建为普鲁兰酶制剂的工业生产提供了有价值的菌株,对化学添加剂促进分泌的研究也为重组酶的高水平胞外生产提供了有效的方法.     

重组角质酶的发酵制备及其对涤纶纤维的表面改性

对大肠杆菌表达嗜热子囊菌Thermobifida fusca角质酶的摇瓶诱导条件及3 L发酵罐扩大培养进行了研究,并探讨了角质酶对涤纶纤维的改性作用。结果表明,在摇瓶培养中,采用工业级TB培养基,用2 g/L乳糖诱导,菌体培养至对数生长前期添加0.5％甘氨酸,角质酶产量可达到128 U/mL。在3 L发酵罐扩大培养中,补料培养生物量 (OD600) 最大达到35,角质酶酶活最高达506 U/mL,是迄今国内外报道细菌来源角质酶的最高水平。紫外分光光度法分析初步表明涤纶纤维经角质酶水解产生了对苯二甲酸类物质     

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶

为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-p ET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-p ET21a液体深层发酵的培养基。50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、p H控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量。通过优化发酵过程控制p H和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/m L,达到摇瓶培养的10.1倍。研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值。     

分散泛菌蔗糖异构酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶产量,研究了不同信号肽及发酵条件对蔗糖异构酶在大肠杆菌中重组表达的影响。将携带天然信号肽的蔗糖异构酶基因优化后,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)构建重组表达菌株——ORI菌株,摇瓶发酵总酶活和胞外酶活分别为85 U/m L、65 U/m L。从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接Pel B或Omp A信号肽构建P22和O22菌株,其中P22菌株发酵总酶活提高至138 U/m L,是ORI菌株总酶活的1.6倍;而O22菌株发酵总酶活和ORI菌株无明显差别。采用3.0 g/L的乳糖诱导,P22菌株的蔗糖异构酶总酶活提高至168 U/m L。在3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶分泌的影响,当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g/L(OD_(600)=30)开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1 981 U/m L,同时蔗糖异构酶总酶活达到2 640 U/m L,是已报道大肠杆菌重组表达蔗糖异构酶的最高水平。     

重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化

在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源,最适质量浓度均为10 g/L,培养基最适初始p H为8.0。然后对诱导条件进行优化,确定最适的诱导时机为菌体密度(OD600)达到0.6时,最适的诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间分别为25℃、0.2 mmol/L和20 h。在优化后的培养条件下,菌体密度(OD600)可达8.6,Leu DH和FDH酶比酶活分别达1 543.3和2 572.4 U/L,是优化前的2.0和3.1倍。     

重组酪氨酸酚裂解酶发酵工艺的研究

左旋多巴是治疗帕金森氏病的首选药物,生物酶法合成左旋多巴具有工艺简单、条件温和、立体选择性高和环境友好等优点。本论文以实验室前期构建的表达具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum) TPL (Fn-TPL)的重组大肠杆菌为基础,采用单因素实验通过对5 L发酵罐发酵工艺优化以及补料策略的研究,确定了分批发酵的工艺参数:pH 6. 5,诱导温度30℃,诱导剂乳糖20 g/L。在5 L发酵罐中,进一步研究了10 mL/h、20 mL/h、30 mL/h三个速率的恒速流加对菌体生物量和TPL酶活的影响。结果表明,补料速率为20 mL/h时,生物量最高为30. 43 g dcw/L,体积酶活最高为9 420 U/L,较摇瓶发酵培养活力提高了3. 3倍。     

海洋细菌有机磷酸酐水解酶在大肠杆菌中的分泌表达研究

为了考察一种海洋细菌来源的有机磷酸酐水解酶OPAA4301在大肠杆菌中胞外分泌表达生产的可能性,笔者分别从信号肽和发酵条件两方面对该酶在大肠杆菌中的产量及细胞定位情况进行观测和优化。结果发现,海洋细菌有机磷酸酐水解酶OPAA4301在大肠杆菌中可不依赖信号肽少量分泌至培养基上清中。以胞外酶产量为指标,对诱导剂和甘氨酸添加量进行优化,确定适宜的诱导剂浓度为0.8 mmol/L,适宜甘氨酸添加量为10 g/L。在优化条件下,重组酶蛋白的细胞定位主要由细胞内转变为细胞外,胞外酶活提高108.8倍,达0.28 U/m L,相当于重组蛋白胞外生产能力为0.72 g/L。本研究为重组海洋细菌有机磷酸酐酶的工程化发酵生产提供理论基础。     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

高密度发酵重组大肠杆菌产海藻糖合成酶

酶法催化是目前生产海藻糖的主要手段。本文中,笔者通过高密度发酵重组大肠杆菌产海藻糖合成酶,进而以麦芽糖为底物,催化生产海藻糖。首先根据大肠杆菌高密度发酵条件要求,在揺瓶中对基因工程菌进行了培养基、发酵条件和诱导条件的逐一优化;然后在5 L和50 L发酵罐中进行批次补料发酵的放大实验;最后采用变指数-恒pH法的策略发酵重组大肠杆菌,结果OD_(600)达到97,海藻糖合成酶酶活达到(24 000±350) U/mL,实现了海藻糖合成酶的重组大肠杆菌高密度发酵生产,极大提高了海藻糖的生产效率。     

麦芽糖诱导软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶基因,将基因片段克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103中,转化枯草杆菌WB600得基因工程菌进行外源表达。在1.5%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为6.1U/ml。通过单因素分析和响应面分析对重组枯草杆菌产CGT酶摇瓶发酵条件进行优化。分析得到培养基关键组分麦芽糖,玉米淀粉和酵母粉三者最佳浓度分别为:15.5g/L,13g/L和20g/L。在此条件下,摇瓶培养36h后α-CGT酶活性为17.6U/ml,5L罐分批发酵30h后酶活达到20U/ml (水解活性为1.4×10⁴ IU/ml)。     

优化Bacillus subtilis对异源β-1,4-内切木聚糖酶分泌表达的研究

[目的] 基于信号肽和信号肽酶在分泌系统中的重要作用,探索短小芽孢杆菌来源中性β-1,4-内切木聚糖酶在Bacillus subtilis中的重组分泌表达与优化。[方法] 首先,从短小芽孢杆菌基因组DNA中扩增β-1,4-内切木聚糖酶全长基因,连接到pWB980载体P₄₃启动子下游,转化B.subtilis WB800构建重组菌NZ-X。之后,构建信号肽筛选载体,对23个从B.subtilis 168基因组DNA中扩增得到的信号肽进行筛选。最后,以B.subtilis WB800的xynA基因为整合位点,分别整合过表达SipS和SipT两个主要信号肽酶,考察其对融合不同信号肽异源蛋白分泌的影响。[结果] 重组菌NZ-X成功实现β-1,4-内切木聚糖酶的分泌表达,摇瓶发酵上清液酶活为5.33 U/mL,信号肽筛选结果发现YlaE、YfhK、EglS、YqxI、YpjP信号肽与β-1,4-内切木聚糖酶契合度较高,对应酶活依次为7.15、6.69、6.36、6.32、6.18 U/mL,其中SipS信号肽酶对融合YfhK信号肽的β-1,4-内切木聚糖酶的分泌促进作用最大,摇瓶发酵上清液酶活提高到10.64 U/mL,为NZ-X的1.99倍。[结论] 信号肽优化与信号肽酶过表达联用可有效提高B.subtilis中异源蛋白的分泌表达量。     

碱性果胶裂解酶摇瓶发酵条件的研究

利用碱性果胶裂解酶生产菌株Bacillus subtilis WSH02-02进行摇瓶发酵优化,确定了最适种子斜面培养基、种子摇瓶培养基和发酵摇瓶培养基等培养条件,经14h的摇瓶发酵,酶活最高达到8．29U／mL。     

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究

为了提高重组菌的淀粉酶表达量,以可分泌表达米根霉α-淀粉酶的甲醇快速利用型巴斯德毕赤酵母重组菌为基础,采用摇瓶发酵方式对影响重组菌表达淀粉酶的多个因素进行了研究和优化。摇瓶发酵条件确定为:温度为30℃,pH值为6.0,接种量为2.0(OD_(600)),甲醇补加方式采用前72 h发酵时间内每隔12h添加至终浓度为1.0%,72 h以后每隔24 h添加至终浓度为1.0%,在此条件下获得的淀粉酶最高表达量为47.5 U/mL,且在无机盐培养基中和有机氮源培养基中获得的淀粉酶发酵单位相当。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10%,甲醇流加方式采用DO—Start法控制,在此发酵条件下获得的淀粉酶表达量为440 U/mL,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。     

表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21(DE3)生产重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选,采用溶氧反馈的流加补料策略,进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达,菌体密度最终达到115g/L(WCW)以上,可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上,含量约为1.1~1.2g/L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养,结果表明该工艺能有效的放大,可适用于工业生产。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达

以构建好的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/xylanase为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组蛋白的表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,乳糖作为诱导剂时,重组菌产酶活力33.9 U/mg略高于IPTG作为诱导剂时重组菌产酶活力28.10 U/mg,这为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产木聚糖酶提供了参考依据。