一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

阴道乳杆菌耐热β-半乳糖苷酶的鉴定

利用改良的MRS培养基,从鸡粪样本中分离到多株产β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株。酶学性质分析发现,菌株1-1产生的β-半乳糖苷酶在37℃~60℃相对稳定,37℃酶活力达到183.9NLU/g菌体干重。进一步分析16S rRNA基因序列,确定菌株1-1为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)。扩增分析β-半乳糖苷酶编码基因lacL和lacM,结果发现LacL亚基有642个氨基酸,LacM亚基有321个氨基酸,与罗伊氏乳杆菌MM2-3相应蛋白的相似性分别为86%和84%。     

亚硝基胍诱变选育低温β-半乳糖苷酶高产菌

以野生低温β-半乳糖苷酶产生菌水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)14-1为出发菌株.通过亚硝基胍(NTG)诱变及低温驯化,采用选择性平板初筛和摇瓶复筛,筛选出一株产酶活力比原始菌株提高54%的突变株,该突变株经传5代培养,产酶特性稳定.     

两株保加利亚乳杆菌产β-半乳糖苷酶条件的优化及酶活力测定

目的优化2株保加利亚乳杆菌产β-半乳糖苷酶的培养条件,测定其在最适于产酶条件下的酶活力,并初步观察酶活力稳定性。方法测定2株保加利亚乳杆菌——来源于酸奶的wch9901和标准菌株1．1480在不同培养时间、培养基碳源、摇床转速、气体环境下产生的β-半乳糖苷酶的活力,优化产酶条件。测定2株菌在其最适产酶条件下的酶活力。将制得的1．1480粗酶液分别置冰浴和20℃水浴,每隔1h测定一次粗酶液中β-半乳糖苷酶活力,观察酶活力稳定性。结果2株保加利亚乳杆菌的最适产酶条件分别为：1．1480于30℃有氧静止培养36h;wch9901于37℃厌氧静止培养18h,培养基含乳糖。在最适产酶条件下,1．1480的酶活力为0．321NLU／ml粗酶液,比酶活为2．469NLU／mg蛋白;wch9901的酶活力为0．401NLU／ml粗酶液,比酶活为6．169NLU／mg蛋白。1．1480粗酶液于冰浴可稳定保存6h,于20℃水浴可稳定保存5h。结论wch9901与1．1480的最适产酶条件有所差异,前者产酶迅速,产酶量多。     

元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

从云南省元阳地区采集豆豉样品,并从中分离得到62株乳酸菌菌株。通过脱脂乳平板试验,从中初步筛得到21株具有高蛋白酶活力的菌株,采用茚三酮法测定其蛋白酶活力,复筛出高产蛋白酶菌株YY-1-6L,并对其产酶条件进行研究。结果表明,YY-1-6L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 5.0的明胶诱导培养基中,接种量为3%,35℃发酵培养36 h,其蛋白酶活力高达32.50 U/mL,且K2HPO4、MgSO4能促进蛋白酶产生。     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

天山1号冰川底部沉积层产β-半乳糖苷酶低温菌株的系统发育分析及生理多样性

[目的]通过对天山1号冰川底部沉积层冻土中细菌的分离和产β-半乳糖苷酶低温菌株的筛选,了解天山冻土微生物的物种多样性,并对产β-半乳糖苷酶低温菌株的系统发育和生理多样性进行分析.[方法]以乳糖为主要碳源,X-Gal为显色剂,分离筛选出产低温β-半乳糖苷酶菌株.对细菌常规生理生化实验、最适生长温度、耐盐性、药物敏感性进行测定.根据16S rRNA基因序列初步确定产β-半乳糖苷酶低温菌种的系统进化地位,并采用BOX-PCR指纹图谱技术对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分.[结果]分离到90株可培养低温菌中25株可产β-半乳糖苷酶,其中76％为革兰氏阳性菌.依据生长温度,产酶菌株80％为嗜冷菌,20％为耐冷菌.在系统发育上,产酶菌株隶属于4个类群,其中肠球菌属(Enterococcus)占26％,短波单胞菌属(Brevundimonas)占22％,假单胞菌属(Pseudomonas)占13％.[结论]天山1号冰川底部沉积层冻土中产β-半乳糖苷酶的低温细菌具有比较丰富的物种和生理多样性.     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

豆豉中高产乳酸乳酸菌的筛选及其产酸条件的优化研究

目的 从云南传统发酵豆豉中分离并筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌菌株,并对其产酸培养基组成及条件进行优化探讨.方法 运用紫外分光光度法,对豆豉由来高产有机酸菌株YM-4-3的碳源进行优化.结果 分子生物学鉴定结果表明该乳酸菌菌株属于植物乳杆菌,并将之命名为Lactobacillus plantarum YM-4-3,碳源优化结果表明,乳糖是L.plantarum YM-4-3 菌株生物合成乳酸的最佳碳源,而果糖则是最利于各种主要有机酸合成的碳源,由于此时各常见有机酸的含量均高于其他碳源时的含量,且其总酸含量高达9696.32 mg/L.结论 云南传统发酵豆豉可以成为功能性乳酸菌筛选的菌种资源库,所分离得到的L plantarum YM-4-3产酸能力较强,它可被应用于有机酸发酵及豆豉发酵的酸化处理.     

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌Enterobacter agglomerans B1：筛选鉴定、发酵产酶及其合成低聚半乳糖的研究

从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1.通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化.最佳培养基主要组份为:乳糖1%,酵母粉1%,蛋白胨0.5%;发酵条件为:初始pH7.5,发酵温度25℃,发酵时间26 h.在该培养条件下产酶量为9.7U/mL.利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为:pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液;50℃反应12h.最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析,确定低聚半乳糖产量为40.7%,组分为转移二糖、三糖和四糖.     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYESZ中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4－3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β-半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β-卜半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4－3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β-半乳糖苷酶在pep4－3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究

以愈创木酚为底物,采用平板筛选法筛选得到一株产漆酶菌株WS1-2,形态学特性表明该茵属于绿色木霉.对产酶条件的初步研究结果表明,WS1-2菌株的产酶高峰期出现在接种培养后的第4d.与蔗糖、乳糖、半乳糖和可溶性淀粉相比,以葡萄糖为碳源时,发酵上清液的漆酶活力明显要高,最大值达230U/L.以NH4Cl为氮源,最有利于WS1-2漆酶的产生,漆酶活力最高可达到234U/L.0.01mmol/L的愈创木酚和ABTS对WS1-2产漆酶有明显的诱导作用,3～5mg/L的Tween-80可以明显提高WS1-2的产酶水平.     

采用复合诱变方法选育高产β-半乳糖苷酶菌株

目的:研究复合诱变方法选育高产β-半乳糖苷酶菌株.方法:以马克斯克鲁维酵母为出发菌株,经过紫外线诱变及硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变,从大量突变株中进行筛选.结果:成功地选育出一株高产、稳定的菌株15D,其产酶活力由出发菌的124.5U/mg提高到172.4U/mg,酶活力提高了约1.4倍.结论:该方法选育β-半乳糖苷酶菌株是有效的.     

云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13茵株纤溶酶活性达到97.09 U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株.     

木霉LaTr 01菌株产漆酶发酵的条件

从华南地区采集土样,采用愈创木酚平板筛选产漆酶菌株,获得了一株短周期产漆酶的小型丝状真菌。通过观察菌落特征、生长情况以及显微镜下菌丝和孢子的形态,初步鉴定该菌株为木霉属的一个种（Trichodermaspp、）,命名为木霉LaTr01菌株。通过单因素方法研究该菌产漆酶的发酵条件,结果表明：LaTr01的产酶培养基以麦芽糖为最佳碳源;以酵母提取物为最适氮源;培养24h后加入Cu“比培养开始加入Cu ^2＋LaTr01产酶活高出约1倍。采用麦芽糖、酵母提取物、Cu^2＋浓度L9（3^3）的正交试验优化漆酶发酵条件,结果表明,氮源是影响该菌产漆酶的最重要因素,碳源次之,Cu^＋浓度影响较小;LaTr01菌株产生漆酶的最佳条件为：5g／L酵母提取物、20g/L麦芽糖、1．5mmol／LCu^2＋,Cu^2＋加入时间为培养24h后。在优化的培养条件下,该菌酶活可达480．556U／L。     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

产木质纤维素降解酶真菌的筛选及产酶特性

【背景】利用微生物处理秸秆引起研究者的广泛关注。【目的】筛选生长速度快、木质纤维素降解酶活性强的真菌菌株,用于植物秸秆降解和高效利用。【方法】从自然界采集的样品中分离纯化真菌菌株,利用PDA-愈创木酚和PDA-羧甲基纤维素钠平板初筛,再经过液体发酵检测漆酶酶活、羧甲基纤维素酶酶活及菌丝生长速率复筛目的菌株,通过内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序法对目的菌株进行鉴定,对目的菌株产漆酶和羧甲基纤维素酶活力进行测定及酶学性质研究。【结果】从样品中分离纯化到18株真菌,通过初筛筛选出9株产木质纤维素降解酶真菌菌株,再经过复筛,筛选出一株产漆酶、羧甲基纤维素酶活力高、菌丝生长快的菌株M1,经过分子生物学鉴定M1为糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus),其漆酶酶活为(243.59±1.11)U/mL,羧甲基纤维素酶酶活为(36.03±0.63) U/mL。在5 d的培养期内,菌丝生长速率为(9.43±0.32) mm/d。对菌株M1的发酵粗酶液的酶学性质进行了检测分析,结果表明,所产的漆酶在pH5.0-6.5相对酶活为90%以上,在pH ...     

豆豉中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其谷氨酸脱羧酶酶学特性研究

目的从云南传统发酵豆豉中分离和筛选得到高产γ-氨基丁酸（GABA）的乳酸菌,同时研究其分泌产生的GAD酶学特性,以期为GABA的自动化发酵及GAD的固定化生产提供参考依据。方法通过高效液相色谱分析,筛选到一株高产GABA的乳酸菌,并初步研究其GAD酶学特性。结果从云南传统发酵豆豉中筛选得到高产GA-BA的Lactobacillus plantarum YM-4-3（产量高达5.74 mmol/L,即0.592 g/L）,其最适发酵条件为35℃,MSG含量为3%,初始pH 6.0,静置厌氧（5%CO2）发酵96 h;酶学特性研究结果表明,该菌株由来GAD是一种酸性酶,在酸性条件下稳定,最适反应pH为4.0,最适反应温度40℃,辅因子磷酸吡哆醛的最适浓度为200μmol/L。结论云南传统发酵豆豉可作为筛选具有较强GABA转化能力乳酸菌的资源库,该研究将有助于新型乳酸菌发酵豆豉的研发。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。