一种带有组氨酸标签的新型表达载体的构建及应用

目的:利用基因重组技术,对已有载体pSE380进行改造,获得具有组氨酸标签的新型表达载体.方法:以pSE380载体为出发材料,通过一步反向PCR技术在多克隆位点处添加一个六聚组氨酸纯化标签,并用该载体对xdh外源基因进行克隆表达及纯化验证.结果:测序结果显示该标签已成功插入,xdh基因克隆表达及纯化表明,镍柱亲和层析完全可以将重组的表达蛋白纯化,并达到电泳纯级别.融合标签并没有影响的该重组酶的功能.结论:通过一步反向PCR技术成功地获得了改造psE380载体,该技术为载体的相关改造提供了一种方便可行的方法.     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

肺炎链球菌中青霉素结合蛋白PBP3在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定

【目的】克隆肺炎链球菌R6的pbp3基因,构建原核表达载体并转化大肠杆菌表达,为PBP3的结构及应用研究创造条件。【方法】利用PCR法克隆肺炎链球菌R6中N端截短的pbp3基因(15-413 aa),BamHⅠ和XhoⅠ酶切后插入pGEX-6p-1构建pGEX-6p-pbp3*表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中胞内表达GST-PBP3融合蛋白,Glutathione-Sepharose 4B column亲和纯化GST-PBP3融合蛋白,PreScission Protease切除GST标签,再次过谷胱甘肽亲和层析柱获得纯化的PBP3蛋白。利用PBP3对头孢喹诺的结合试验来鉴定表达蛋白是否有活性。【结果】经测序鉴定成功扩增出N端截短的pbp3基因,成功构建了pGEX-6p-pbp3*表达载体,并纯化出可溶性PBP3蛋白,而且有活性。【结论】肺炎链球菌pbp3基因原核表达系统的成功构建以及有活性重组蛋白的获得,为PBP3蛋白的结构及应用研究奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础.     

细菌脲酶蛋白复合物UreABC的表达与纯化

细菌脲酶能分解尿素为氨,在瘤胃尿素氮代谢中发挥重要作用。为了表达纯化并研究蛋白脲酶复合物UreABC,通过PCR扩增脲酶基因簇的结构基因ureA、ureB、ureC,将ureB构建在含有N端His标签的pet28a+载体,ureA、ureC基因共同构建在含有N端His标签的表达载体pETDuet-1,经酶切及测序鉴定得到正确的阳性克隆后,将两个质粒共同转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导表达UreABC融合蛋白。采用SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白表达进行鉴定,再通过蛋白纯化仪的镍柱、脱盐柱、分子筛纯化目的蛋白。结果显示,成功构建了两个原核表达载体pET28a-ureB、pET-ureCA,脲酶基因ureA、ureB、ureC片段大小分别为313、315、1 701 bp,以可溶性形式表达脲酶蛋白复合物,并通过纯化得到约240 kD的蛋白。通过脲酶活性测定试验发现,镍离子可以体外激活脲酶蛋白。通过原核表达系统成功表达和纯化了具有活性的脲酶蛋白,为研究蛋白结构以及其与辅助蛋白互作提供参考。     

细粒棘球蚴FABP基因的原核表达及蛋白鉴定

构建原核表达载体pET-FABP,优化表达条件,采用免疫学方法鉴定纯化的FABP融合蛋白。载体pMD19-T-FABP和pET-44a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将回收的FABP片段与pET-44a(+)连接,构建原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,优化表达条件,纯化FABP融合蛋白,Western blotting鉴定。成功构建了原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌中高效表达。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确。构建的表达载体pET-FABP可以在大肠杆菌中大量表达Nus-FABP融合蛋白,为进一步研制FABP亚单位疫苗奠定了基础。     

高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO

目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验 证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表达.方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得I L-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质粒经鉴定后转化到大肠杆 菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况.结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的 高效可溶性表达.利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟 蛋白且不残留任何氨基酸残基.结论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量.     

重组白喉毒素表达质粒H21G-his序列分析及改造研究

以源自国外的重组白喉毒素表达质粒H21G-h is为模板,利用PCR技术,扩增H21G-h is的基因并测定核苷酸序列,确证重组白喉毒素表达质粒H21G-h is的突变位点;对表达载体多克隆位点上下游的功能序列进行测定,确定组氨酸标签位置;在基于对载体正确分析的基础上,改造质粒,除去组氨酸标签,表达天然蛋白;利用pET表达系统重新构建新的非融合表达载体,并对表达量进行比较,为该蛋白作为载体用于多糖结合疫苗奠定基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

人造血相关PBX相互作用蛋白的原核表达及纯化鉴定

目的:构建带His标签的人造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的原核表达载体,获得His-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入载体p ET-28a(+)中,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate株进行小量诱导,挑选能诱导出His-HPIP的菌液进行融合蛋白的纯化,采用SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的纯化效果,采用GST pull-down技术对蛋白的生物学功能进行初步鉴定。结果:双酶切和测序结果表明His-HPIP原核表达质粒构建成功;His pull-down实验证实His-HPIP蛋白和雌激素受体α存在相互作用,说明生物学活性良好。结论:原核表达并纯化出His-HPIP融合蛋白,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

生物活性肽Lunasin 的原核表达和分离纯化

目的:利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法:将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果:①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论:在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

铁蛋白轻链真核表达载体的构建

目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。     

人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。     

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP PreS1 PreS2 S、PreS1 PreS2 S、PreS2 S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化

大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定.提取感染HCMV Towne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒.将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达.表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测.结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白.为进一步研究pUL23奠定基础.