线粒体未折叠蛋白反应分子机制的研究进展

线粒体未折叠蛋白反应(UPR~(mt))作为新发现的细胞内应激机制,直接影响老化、神经退行性疾病、癌症等疾病的发生发展.UPR~(mt)是线粒体为了维持其内部蛋白质的平衡,启动由核DNA编码的线粒体热休克蛋白和蛋白酶等基因群转录活化程序的应激反应.深入探究UPR~(mt)的作用机制对阐明老化和线粒体相关疾病的发病机理具有指导意义.本文主要阐述了线粒体未折叠蛋白反应的诱导因素、线虫和哺乳动物细胞中最新的未折叠蛋白应激反应的信号传导通路、调控因子、具体作用机制以及线粒体未折叠蛋白反应与衰老、免疫等疾病的联系,旨在为这些疾病提供新的理论基础和治疗靶点.     

铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。[方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。[结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。[结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。     

基因敲除小鼠技术的发展和应用——2007诺贝尔生理或医学奖介绍

人类对于自身基因功能的研究是生物学领域非常重要的一项内容.随着人类基因组计划的完成和人类基因信息的不断完善,基因功能的研究已成为近年来国际上的热点.基因敲除小鼠技术的建立和发展使得科学家们能够从分子、细胞及动物整体水平研究特定基因在生物发育、生理以及病理中的作用,对生命科学的发展具有革命性的意义,对临床疾病的认识和治疗也起到了关键的推动作用.这项技术的发明者因此获得了2007年诺贝尔生理或医学奖.     

新鲜眼球保存方法的比较

眼球的解剖与观察是《组织学与解剖学》教学实践的重要内容,如何简便易行地保存完整新鲜的动物眼球是实验能否成功的关键环节。探讨了冷藏保存、冷冻保存、YEZEAL于泽~(TM)固定液保存3种新鲜眼球的保存方式。结果显示,冷藏保存的眼球结构观察效果最差;冷冻保存的眼球可以更感性地认识眼球外形、清晰辨认内容物;YEZEAL于泽~(TM)固定液固定的眼球对认识视网膜的形态和结构效果最好。因此,在眼球解剖与观察中,冷冻保存和YEZEAL于泽~(TM)固定液保存方法效果最好。     

SIRT2去乙酰化酶活性位点突变体的构建及活性鉴定

[目的]构建人沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,SIRT2)的去乙酰化酶活性位点突变体，并验证其去乙酰化酶活性。[方法]设计合成人SIRT2的酶活性关键位点(Q167、N168和H187)突变基因PCR引物。利用重叠延伸PCR技术，获得hSIRT2突变基因。利用分子克隆技术构建hSIRT2突变体。利用Western Blot技术检测hSIRT2突变体的表达及其去乙酰化酶活性。[结果]成功获得了hSIRT2的168、187、167/168双位点和167/168/187三位点突变基因，片段大小为1 190 bp。所构建的突变基因重组质粒经DNA测序验证，显示成功插入。细胞内检测到清晰明确的突变体的表达信号。与野生型SIRT2相比，突变体的去乙酰化酶活性具有不同程度的改变。[结论]成功构建了hSIRT2的4种不同的去乙酰化酶活性位点突变体，其去乙酰化酶活性有不同程度降低。     

铁蛋白轻链真核表达载体的构建

目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。