一种新的肝细胞生成素（HPO）转录本及其生物学活性

利用 5′RACE技术从人胎肝组织中分离一种新形式的肝细胞生成素 (HPO 2 0 5 )cDNA ,其编码蛋白质氨基酸序列的N端较已报道的人肝细胞生成素HPO(hepatopoietin)多 80个氨基酸 ,推测其蛋白质分子量为 2 3kD。RT PCR检测HPOmRNA在多种肝癌细胞中表达 ,Western印迹可检测到 2 3kDHPO 2 0 5表达 ,表明此种形式HPO在自然状态下存在。将构建的HPO 2 0 5真核表达载体转染入COS 7细胞 ,其表达蛋白质能够刺激HepG2肝癌细胞DNA合成 ;将HPO 2 0 5、HPO和荷空表达载体分别转染入低水平表达HPO的Bel 740 2肝癌细胞株 ,发现HPO 2 0 5比HPO具有较强的激活MAPK磷酸化的活性。细胞周期分析稳定转染HPO 2 0 5 ,HPO细胞的增殖周期也支持这一结论。这些结果表明HPO 2 0 5具有刺激肝源性细胞增殖的活性 ,并提示HPO 2 0 5可能较HPO有更强的生物学活性     

TEC酪氨酸激酶基因是一种与肝再生调控相关的早期反应基因

 肝再生过程中立即早期反应基因的表达在成熟肝细胞由G0 期向G1期的转变中起着关键作用 .为探讨肝再生早期基因表达的变化 ,利用表达性差异显示分析 (RDA)技术研究了 2 3肝部分切除后 1h再生肝选择性基因表达 ,发现一株TEC酪氨酸激酶同源序列存在于差减产物中 ,RNA狭缝杂交证实确为差异表达基因 .从大鼠肝cDNA文库中分离其全长cDNA ,序列分析结果表明 ,该基因为小鼠 人TEC酪氨酸激酶的同源体 ,进而以该cDNA为探针 ,用Northern杂交证实 2 3肝部分切除后TEC酪氨酸激酶基因在 1h内呈现瞬间表达增加 ,其表达水平较基础水平增高 2 5倍 ;在原代培养大鼠肝细胞体系中 ,EGF可迅速诱导TEC基因表达 ,且不被蛋白合成抑制剂阻断 .结果表明 ,TEC基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因 .     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

JNK3通过与RelA/p65相互作用抑制NF-κB信号通路减弱Bel-7402细胞的黏附能力

JNK信号通路在细胞的炎症、增殖与凋亡等生物学过程中发挥了重要的作用．我们采用酵母双杂交技术发现转录因子p65是JNK3的相互作用蛋白质．体内体外实验均证实JNK3与p65存在蛋白质相互作用．报告基因实验结果表明过表达JNK3抑制TNFα诱导NF-κB介导的转录激活．EMSA结果证明JNK3减弱NF-κB的DNA结合能力．实时定量PCR结果表明JNF3减少NF-κB靶基因的表达．综上所述,我们的研究结果表明JNK3做为一个调节分子在体内发挥了抑制p65转录活性的功能．     

在NIH3T3细胞中高表达EDAG—1基因导致细胞恶性转化

探讨一种新近克隆的特异表达在造血系统组织和细胞中的胚胎发育相关新基因 (EDAG 1)的生物学功能。构建EDAG 1真核表达载体pcDNA3.1( ) EDAG 1,以脂质体法将其稳定转染入NIH3T3细胞中 ,结果发现高表达EDAG 1的NIH3T3细胞失去了正常的平行走向及接触抑制现象 ,侵袭力较正常增强约 10倍并获得锚定不依赖生长能力。将该细胞株皮下接种裸鼠 ,受鼠在 4周左右 10 0 % (6 / 6 )成瘤。这些结果表明EDAG 1是一种具有转化活性的新基因 ,可能与肿瘤发生、发展密切相关     

EDAG—1，一种与造血调控密切相关新基因的分离和确认

以代表性差异显示分析技术（RDA）获得一种在人胎肝组织中高丰度表达的胚胎发育相关基因1（embry-onic develop associated gene1,EDAG-1）,经筛选cDNA文库及5′末端cDNA快速扩增技术（rapid amplification of cDNA 5′end,5′RACE）获得其全长为2166bp的cDNA。该基因含编码484个氨基酸组成蛋白质的ORF,Blast检索表明编码蛋白质不含任何已知蛋白质功能结构域,与小鼠Hemogen及大鼠RP59基因同源。其mRNA3′端非释译区序列含2拷贝AUUUA结构,表明该基因mRNA稳定性差。体外翻译证明该基因编码蛋白质分子量为55.3kD,与理论预测值一致。Northern杂交及PCR检测表明该基因主要表达在成人在及胚胎胪组织,在K562和MO7e两株人髓性白血病细胞系中也有较高丰度表达。氯高铁血红素及红细胞生成素EPO（erythropoietin）诱导K562细胞向红系分化过程中,EDAG－1的表达随细胞的分化迅速下调;这些结果提示EDAG－1可能是一种与造血细胞分化调控密切相关的新基因。     

造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

EDAG是在胚胎发育阶段造血干细胞特异性表达的基因.为了在早期造血组织细胞中实现相关基因的条件敲除,构建了含有早期造血组织特异性表达的EDAG启动子和Cre重组酶基因的转基因EDAG-Cre表达载体质粒.通过显微注射的方法将线性化的5.6kb的EDAG-Cre转基因片段导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生小鼠经过PCR鉴定,常规方法培育传代.结果发现,共获得了6只阳性转基因首建鼠,其中4只已经建系并稳定传代.RT-PCR分析表明Cre重组酶基因在阳性转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、外周血以及胎肝等组织中均有表达,重组酶活性也在脾和骨髓中获得确认.EDAG-Cre重组酶转基因小鼠的建立,为研究早期造血组织以及造血干细胞特异性基因条件敲除小鼠模型的建立奠定了基础.     

一种新型丝氨酸苏氨酸激酶CPK的初步克隆及功能

从人胎肝cDNA文库中分离到一种cDNA ,推测的蛋白氨基酸序列具有明显的丝氨酸苏氨酸激酶结构域,可能编码一种新的丝氨酸苏氨酸激酶(命名为CPK ,cellproliferationassociationkinase) .CPKmRNA全长约3 0kb .RT PCR检测表明CPKmRNA在增殖活跃组织或细胞如人胚胎组织、肿瘤细胞株中呈高丰度表达,在成人组织则呈低丰度或不表达.利用PCR技术扩增大鼠同源cDNA ,以此为探针,Northern杂交发现CPK表达于多种成年小鼠组织,以脑组织丰度最高.小鼠2 3肝部分切除可迅速诱导CPKmRNA的表达,在术后2 4～4 8h达高峰,与2 3肝部分切除后细胞增殖期吻合.以小鼠同源cDNA片段为模板,合成RNA探针,原位杂交显示在胚胎发育期CPK低丰度表达在大多数组织,以神经系统组织变化最大,在第8d胚胎神经管内皮细胞中即出现表达,11～13d在端脑、脑膜、间脑、脊神经节表皮细胞、海马、小脑神经胶质细胞等多种神经细胞中表达且丰度较高,16d后这些组织的表达迅速下降到较低水平,表明CPK可能与神经系统的生长发育有一定关联.利用信号通路检测技术,观察到CPK的表达对MAPK ,p38MAPK途径的激活有明显的影响,并可显著增强表皮生长因子对这两条途径的激活,提示该激酶可能参与细胞因子的信号转导.