大黄鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因间序列功能分析

石首鱼类属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、石首鱼科（Sciaenidae）。它们是一群较暖水性鱼类,分布范围广泛。由于中国大陆架面积非常广大,为一浅海盆地,且多为泥沙底质,环境很适合石首鱼类的生长,故种类繁多,有13属37种,居世界首位。但多年来的狂捞滥捕加上外部生态环境的恶化,导致中国近海的许多石首鱼类野生资源枯竭,因此南部沿海许多地区开展了石首鱼类的人工养殖。大黄鱼、黄姑鱼、双棘黄姑鱼、美国红鱼都是我国沿海重要人工养殖石首鱼类。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼 (Pseucdosiaenacrocea)脑下垂体中提取得到总RNA ,根据近源鱼种生长激素(GH)基因保守序列设计了上游和下游引物 ,通过反转录和PCR扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断 ,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性 ,断定为大黄鱼生长激素基因序列 ,本序列的测定对进一步研究其生物活性和在工程菌中的表达及应用打下了基础。     

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼（Pseucdosiaena crocea)脑下垂体中提取得到总RNA,根据近源鱼种生长激素（GH）基因保守序列设计了上游和下游引物,通过反转录和PC扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性,断定为大黄鱼生长激素基因序列,本序列的测定对进一步研究其生物活性和工程菌中的表达及应用打下了基础。     

鲤形目五种鱼α-珠蛋白基因cDNA的克隆

从血液中提取总RNA,根据α珠蛋白氨基配序列的N末端和C末端碱基序列的保守性设计20个碱基长的简并引物,用RT-PCR方法扩增并克隆了鲤鱼(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫鱼(Carassius auratus)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)5种我国常见鱼类的α-珠蛋白基因cDNA。序列同源性检索表明：所克隆的cDNA片段为这5种鱼各自的α-珠蛋白基因,其GenBank注册号分别为AF528156、AF528157、AF528197、AF528198、AF528199;克隆的5种鱼的α-珠蛋白基因氨基配编码序列均为429bp。氨基配序列比较后发现：泥鳅与大鳞副泥鳅的相似性最高为94．41％;大鳞副泥鳅与草鱼的相似性最低为83．92％;其余的相似性介于二者之间。另外,对已克隆的α-珠蛋白基因用Within-group方法进行了聚类分析,聚类结果显示：进化关系较近的物种α-珠蛋白氨基酸序列的相似性与其从形态解剖所得的系统进化关系是一致的;进化关系较远的物种α-珠蛋白氨基酸序列的相似性与其生存环境具有较密切的关系。     

神经珠蛋白研究进展

神经珠蛋白(Neuroglobin,Ngb)是最近由德国科学家发现的一种新的珠蛋白类型。目前,已从人、小鼠和鱼类的组织中获得了基因序列。研究发现,人神经珠蛋白(hNgb)的mRNA序列全长7727bp,含11个重复序列,4个外显子和3个内含子,编码151个氨基酸。与鼠神经珠蛋白(mNgb)相比核苷酸同源性为94％。鱼的神经珠蛋白(fNgb)编码159个氨基酸,分子量约为16kD。Ngb具有高氧亲和性和可逆性结合氧的功能。并能协助氧气通过血脑屏障,在神经细胞代谢中增加氧的运输、储存和供应。对其进一步研究将为生物医学和生命科学提供新的思路,也将开辟一个全新的市场。     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素(Hm)对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β-珠蛋白基因的转换机制相关。 Abstract: The recombinant plasmid HG was constructed,in which the reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was driven by the β-globin promoter and regulated under the HS2 element.The inductive effect of hemin on the expression of the β-globin gene and transiently transfected β-globin genes in K562 cells was analysed by FACS as well as RT-PCR method.The results showed that the level of γ and β-globin gene mRNA in K562 cells increased significantly after 24,48 and 72 hours induced with 30 μmol/LHm.And this inductive effect was sronger after 24 and 48 hours.Furthermore,the transient expression of plasmid HG in K562 cells increased significantly with hemin induction.These results indicated that the mechanism of inductive erythroid differentiation with hemin may be correlated with mechanism of γ→β-globin gene.     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。     

碱性Krueppel样因子对和珠蛋白基因的转录调控作用

为探索碱性Kruppel样因子（basic Krueppel-like factor,BKLF)对γ-和ε珠蛋白基因的转录调控作用,构建了人类BKLF(hBKLF)基因全长及N端缺失40个氨基酸的真核表达载体,并将其瞬时转染到COS7细胞中做报告实验。结果表明,hBKLF能够抑制γ-和ε-珠蛋白基因启动子的活性,而hBKLF特异的反义核酸则激活这两种基因的启动子。N端缺失40个氨基酸不影响这种转录抑制功能。hBKLF强烈抑制FKLF(embryonic/fetalβ-like globin gene-activating Krueppel-like factor)引起的对γ-和ε-珠蛋白基因的转录激活作用。另外BKLF基因能够与SHP1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase1)基因启动子区的CACCC元件结合。这些结果提示γ-和ε-珠蛋白基因可能是BKLF的转录调控对象,为研究BKLF参与血细胞特异表达基因的调控提供了依据。     

大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的研制

针对近年来由虹彩病毒所引起的海水养殖鱼类疾病呈日趋严重的态势,该文在证实了引发我国大黄鱼大规模流行病的病原为一种虹彩病毒及测定病毒全基因组序列(111,760bp;GenBank accession numberl．AY779031)的基础上,通过与已报道虹彩病毒核酸序列进行分析比较,结合生物信息学手段,确定了以虹彩病毒ATPase基因保守区序列(295bp)作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,通过改进PCR模板的制备方法和优化扩增条件,建立了大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,模板制备时间约30min、回收率为52％、半个工作日即可得到准确的结果,无非特异性扩增带,适用于大黄鱼虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种的检疫及水质环境的监测,目前正在推广应用。     

基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体转染法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT-PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2-HS3及近侧元件在瞬时表达中对β-珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况.结果显示,3.2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β-启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无明显协同作用.     

湖北石首麋鹿国家级自然保护区麋鹿种群动态

为实现麋鹿回归大自然的目标,1993年和1994年,湖北石首麋鹿国家级自然保护区(以下简称石首麋鹿保护区)分别从北京麋鹿苑引入麋鹿30头(8♂,22♀)和34头(10♂,24♀)建立了繁殖种群。自2000年6月开始,作者每月一次(7-10d)实地监测石首麋鹿保护区内、外的麋鹿种群动态。到2006年产仔季节结束后,该保护区内的麋鹿种群达522头,2006年产仔前性比为1∶1.22。用指数增长模型拟合种群增长曲线,1998年后石首麋鹿保护区内的麋鹿种群呈指数增长(Nt=84e0.226t),其瞬时增长率为0.226;1998年夏季长江暴发特大洪灾,石首麋鹿保护区内的部分麋鹿逃逸到长江南岸,形成了自然野化麋鹿种群。该自然野化种群比保护区内麋鹿种群增长快,其瞬时增长率达到0.267。湖北石首和江苏大丰两个国家级自然保护区内麋鹿种群的出生率和增长率差异显著,而两地的死亡率无显著差异。石首麋鹿保护区内的麋鹿种群年均出生率(26.8%,P=0.010)和年均增长率(21.7%,P=0.038)均显著地高于江苏大丰国家级自然保护区内麋鹿种群的年均出生率(21.6%)和年均增长率(17.0%)。由于生境退化和人为干扰,当前石首麋鹿保护区内的麋鹿种群增长已开始出现密度制约迹象,亟待采取有效措施来改善麋鹿的生存繁衍条件。     

高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的克隆与测序

目的:通过对高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的分析,探讨藏族Hb高氧亲合力的分子机制.方法:高原现场采集健康成年男性藏族人骨髓样品,提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得人α和β珠蛋白的cDNA,与PGEM-T Easy质粒连接后,将α和β珠蛋白的cDNA转化JM109大肠杆菌中扩增培养,经酶切鉴定后测序,结果与NCBI数据库进行同源性比较.结果:藏族人α珠蛋白的cDNA与NCBI数据库登录的人cDNA序列相同,没有突变位点.一例藏族人β珠蛋白143位密码子发生了氧亲和力增高的碱基突变(CAC-＞CGC),其对应的氨基酸由His变为Arg(即Hb Abruzzo).结论:藏族人高氧亲和力变种的发现,为今后高原低氧适应相关基因的研究提供了线索.     

与人体β-珠蛋白基因5'旁侧正调控区(PCR)相结合的调控因子(简报)

β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的理想模型,在它的5个结构基因(ε,~Aγ,~Gγ,δ和β)中,成年型的β-珠蛋白基因主要在出生后人的骨髓中表达。过去的研究表明,在β-珠蛋白基因的5′旁侧序列内至少存在三个调控元件,即两个负调控区     

溃烂症眼斑拟石首鱼分离的灿烂弧菌的鉴定

摘要：【目的】从患溃烂症的眼斑拟石首鱼分离到优势菌株M-1,并进一步对该菌的系统发育学进行了分析。【方法】采用形态学、生理生化鉴定,结合16S rRNA和HSP60基因序列分析。【结果】16S rRNA基因同源性分析,菌株M-1与灿烂弧菌(AJ874361、AY046955)聚为一群;HSP60基因(groES)序列分析表明M-1与弧菌(EU653883、AY837440)聚为一个分支。【结论】菌株M-1属于灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。     

紫黑翼蚌钩介幼虫寄主鱼的人工筛选及寄生包囊形成观察

选取16种鱼类, 对紫黑翼蚌(Potamilus alatus)钩介幼虫寄主鱼进行人工筛选试验, 结果表明: 仅在淡水石首鱼(Aplodinotus grunniens)上获得变态发育的稚蚌, 寄生变态率为(49.6±9.4)%, 但是过量寄生将导致淡水石首鱼的死亡。除眼斑拟石首鱼(Soiaenops ocellatus)外, 寄生在其他14种淡水鱼类均不可能实现钩介幼虫的变态。进一步扫描电镜观察显示: 钩介幼虫可在与淡水石首鱼同科的眼斑拟石首鱼鳃丝寄生并形成完整的包囊, 且在大规格鱼体形成包囊的速度明显快于幼鱼。但在寄生和淡水低渗双重胁迫下, 眼斑拟石首鱼出现极高的死亡率, 提示应进一步开展淡化驯养以提高眼斑拟石首鱼寄生后的成活率。其中黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、小口黑鲈(Micropterus dolomieu) 、蓝鲶(Ictalurus furcatus)寄生后1—2d内脱落的幼虫几乎全部死亡, 推测3种鱼体中可能存在紫黑翼蚌幼虫的致死因子。综合研究表明: 紫黑翼蚌是目前发现对寄主鱼选择性最为专一的蚌类, 而眼斑拟石首鱼具有作为替代寄主鱼的潜能。     

白木香3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析

以白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

K型小麦细胞质雄性不育系育性恢复基因的RAPD和ISSR标记

利用RAPD和ISSR分子标记对K型小麦(Triticum aestivum L.)雄性不育恢复系LK783的主效恢复基因进行了标记定位.以K冀5418A//911289/LK783三交F1分离群体的极端不育株和极端可育株分别建立保持池和恢复池,利用418个RAPD和33个ISSR引物对两池间的多态性进行了研究.分析表明RAPD引物OPK18和ISSR引物UBC-845在两池间扩增出稳定的多态性差异,在分离群体上的验证结果表明LK783的育性恢复基因与两个引物的扩增位点有连锁关系,在染色体上位于两个引物的扩增位点之间,与OPK18450的遗传距离为(15.07±6.28)cM (centiMorgan),与UBC-845800的遗传距离为(8.20±4.85)cM.这两个引物可应用于对育性恢复基因的标记辅助选择.最后,利用中国春缺体-四体系和双端体系进一步将UBC-845800定位于1BS, 表明LK783的育性恢复基因也位于1BS.     

鸡α-珠蛋白基因 5''''端 MAR调控GFP的表达

目的观察不同细胞密度、不同转染时间MAR对GFP表达的影响.方法采用脂质体法将pcmv/gfp与pgfp/mar两个真核表达载体转染人的神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y).结果在细胞密度为3.0×10 5cells/ml,转染后72h GFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下,pgp/mar比pcmv/gfp表达要高.结论初步证明该MAR能够提高GFP的表达.     

低氧-酸化胁迫对大黄鱼早期发育 阶段生长及生理代谢的影响

为探究低氧-酸化胁迫对大黄鱼(Larimichthys crocea)早期发育阶段生长及生理代谢的影响,实验设置4个处理组,分别为对照组(溶解氧7.0 mg/L,pH 8.1)、低氧组(溶解氧3.5 mg/L,pH 8.1)、酸化组(溶解氧7.0 mg/L,pH 7.3)和低氧-酸化组(溶解氧3.5 mg/L,pH 7.3)。每个处理组4个重复,每个重复放置大黄鱼受精卵4.0×10~4粒。在实验开始(记录为0 d)和受精卵孵化后1 d、3 d、5 d、10 d、15 d、20 d、27 d测定其类胰岛素生长因子-1(IGF-Ⅰ)和生长激素(GH)含量,以及丙酮酸激酶(PK)、谷丙转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(AKP)和钠钾ATP酶(NKA)活性。并测定27 d时的体长和体高。实验结果表明,低氧和酸化胁迫在27 d均显著抑制大黄鱼体长、体高的增长,低氧-酸化双重胁迫的抑制效果更为明显。类胰岛素生长因子含量分别在3个处理组的多个时段显著低于对照组(P 0.05),其中,3个处理组类胰岛素生长因子含量在3 d时均显著低于对照组(P 0.05)。生长激素含量在不同处理组中均出现升高的趋势,27 d时3个处理组均高于对照组(P 0.05)。丙酮酸激酶活性在低氧-酸化组1～5 d时显著高于对照组(P 0.05),其他三个组的变化基本上呈现出先升后降的趋势。谷丙转氨酶活性在3个处理组中的多个时间点显著高于对照组(P 0.05)。3个处理组中碱性磷酸酶活性在3 d时显著低于对照组(P 0.05)、15 d时显著高于对照组(P 0.05)。3个处理组钠钾ATP酶活性在3 d时均显著低于对照组(P 0.05)。综合分析得出,在本实验条件下大黄鱼早期发育阶段在低氧和酸化胁迫的环境中个体生长均会受到抑制,低氧-酸化的双重胁迫对其抑制作用更显著。各处理组的代谢酶活性在多个时段与对照组相比发生显著性变化,结合本实验中大黄鱼个体生长差异和代谢酶活性差异的分析得出,低氧和酸化胁迫导致大黄鱼主要代谢酶活性产生了响应性的变化,进而最终影响了大黄鱼的个体生长。