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利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓(Lumbricus rubellus)中分离的FⅠ0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae 的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物, 经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp, 编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank 登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。 相似文献
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猪肝酯酶(Pig Liver Esterase,PLE)是手性合成工业中最常用的三种生物催化剂之一,它的生化提取物是多种同工酶(α、β和γ亚基)的混合物,而它的单一组分(7亚基)有很高的手性拆分活性。为获得重组PLE,从猪肝提取总RNA,经RT—PCR得到γ亚基目的基因,并利用pPIC9K质粒构建成pPIC9K—PLE表达载体,转化到Pichia pastoris中,转化细胞株摇瓶发酵表达重组PLE达450mg/L.活性染色证明分子量略低于天然酶。 相似文献
3.
从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454)。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ)。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。 相似文献
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蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证 总被引:2,自引:0,他引:2
利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓(Lumbricusrubellus)中分离的F-Ⅰ-0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物,经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp,编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。 相似文献
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编码纤维蛋白β链N末端七肽(β七肽)的寡核苷酸片段,通过基因重组技术插入到金葡核酸酶(P-1蛋白)基因的5′端。在P_RP_L启动子的调控下,β七肽以融合蛋白(β七肽·P-1)的形式在E.colfi细胞中得到高效表达。以纯化的融合蛋白为免疫原,制备出抗β七肽抗体;纤维蛋白原(FG,4g/L抑制实验证明,该抗体对纤维蛋白(FP)有特异性反应。 相似文献
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蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析 总被引:15,自引:1,他引:14
通过以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析,从蚯蚓(大平二号, 即赤子爱胜蚓)纯化出的纤溶酶是一组非均一的纤维蛋白水解酶.经DEAE-纤维素离子交换和制备电泳进一步分离纯化,得到12个单一组分. 这些组分的等电点(pI)按照它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上的顺序从4.0开始依次降低; SDS-PAGE证明, 除3、4外,其余组分均只含一种多肽链,分子质量在22~34 ku之间;用shiff试剂和酚-硫酸染色, 显示1、2、6.5和7是糖蛋白,其中7的糖含量最高; 以BAEE、Chromozym UK和Chromozym PL为底物测定,7的纤溶酶活性最高. 相似文献
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通过聚合酶链反应 ( PCR)自人脾 c DNA扩增 RO 蛋白 ( 60 k D)编码 DNA片段 .将该片段定向插入麦芽糖结合蛋白 ( MBP)融合系统的 p MALTM- c载体中并转化 E.coli ( DH5α) ,通过酶联免疫印迹 ( IBT)筛选出具有 RO 抗原性的阳性克隆 .绝大部分阳性克隆表达完整的 RO 融合蛋白 ( 1 0 0k D) .但在传代过程中表达水平很快降低 ;少数阳性克隆虽然表达非完整 RO 融合蛋白 (分子量 <80k D) ,但表达水平却高而且稳定 .同时保留了很强的 RO 抗原性 .产生非完整融合蛋白的一个原因是 ,PCR碱基错配引起 RO 编码 DNA的序列缺失 ;另一原因是融合蛋白在表达过程中被降解 相似文献
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碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质,本文适时加入较高浓度的RNA和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体,该法揉作简单,经济,实用。 相似文献
9.
蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS—PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。 相似文献
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从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolyti cenzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454)。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ)。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。 相似文献