大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼（Pseucdosiaena crocea)脑下垂体中提取得到总RNA,根据近源鱼种生长激素（GH）基因保守序列设计了上游和下游引物,通过反转录和PC扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性,断定为大黄鱼生长激素基因序列,本序列的测定对进一步研究其生物活性和工程菌中的表达及应用打下了基础。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

新疆3种雅罗鱼线粒体DNA控制区序列的差异和系统进化关系

对分布在新疆的准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)、贝加尔雅罗鱼(Leuciscus leuciscus baicalensis)和高体雅罗鱼(Leuciscus idus)3个鱼种共24尾个体的线粒体DNA D-loop控制区核苷酸序列进行了测定,获得24条长度为667—669bp的同源基因序列。3种雅罗鱼之间的序列差异在6．39％—9．89％之间,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼种间序列同源性高,变异程度小;贝加尔雅罗鱼与准噶尔雅罗鱼种间序列同源性最低,变异程度最大。所采集的贝加尔雅罗鱼两个地理群体(赛里木湖和额尔齐斯河)内mtDNA的平均核苷酸碱基序列差异为1．07％和1．08％;两群体间的序列差异为1．07％,显示两个地理群体间无明显分化。DNA序列数据显示,这3种鱼类线粒体DNAD-loop序列变异丰富,24尾个体呈现独自的单倍型。同源基因序列平均含AT碱基64．1％,GC碱基35．9％,显示准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼、高体雅罗鱼的线粒体DNAD-loop区核苷酸组成的不均一性。分子系统树提示,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼亲缘关系较近,准噶尔雅罗鱼是3种雅罗鱼中较古老的鱼种。     

大黄鱼ubc9基因的克隆和组织表达

类泛素化(sumoylation)是一种重要的转录后修饰过程.激活的SUMO(small ubiquitin-related modifer)和E2结合酶结合稳定后共价结合到底物上,从而完成对底物的类泛素化.UBC9(ubiquitin-conjugating enzyme)作为惟一的E2结合酶,在完成类泛素化中起着重要作用.从已构建的大黄鱼性腺线性化cDNA文库中筛选出ubc9同源片段,用SMART-RACE方法克隆得到了846 bp的全长cDNA序列.该序列编码一个由158个氨基酸组成的蛋白.该蛋白序列与已知的UBC9高度同源,含UBC保守结构域和UBC9激活位点区域.实时定量PCR分析ubc9基因在各组织器官的表达,结果发现,ubc9基因在大黄鱼的性腺中大量表达.推测UBC9在大黄鱼性腺发育中起重要的生物学作用.     

革胡子鲶生长激素cDNA克隆与蛋白质结构分析

从革胡子鲶(Clarias lazera(Burchell))的脑垂体组织中提取总RNA, 应用RT-PCR方法, 扩增得到了革胡子鲶生长激素(Growth hormone, GH)基因cDNA的开放阅读框(Open reading frame, ORF)序列。ORF全长为603 nt, 编码由22个信号肽氨基酸和178个成熟肽氨基酸共同组成的生长激素前体蛋白。序列同源比较结果表明, 研究中得到的革胡子鲶生长激素氨基酸序列与GenBank中已报道的其他6种鲶形目鱼类的氨基酸序列同源性高达95.8%。二级结构预测分析结果表明, 革胡子鲶生长激素蛋白中含有a 螺旋、b 折叠和b 转角以及无规卷曲等二级结构, 以a 螺旋为主, 是典型的a 型结构蛋白质。此外, 抗原性分析表明, 在氨基酸序列中的4个区域均可形成优势抗原表位, 其结构特点非常适合改造成为重组生长激素疫苗或单克隆抗体制剂加以开发利用。     

猪生长激素cDNA的全序列分析

本文报道了两个猪生长激素cDNA的全序列分析的结果。猪生长激素cDNA是我们由猪垂体mRNA经过反向转录、克隆和筛选后获得的。文中还将这两个序列与Seeburg等(1983)报道的序列以及Vize等(1987)报道的猪基因组生长激素基因的序列进行了比较和讨论。     

美国红鱼生长激素基因的克隆及其遗传进化分析

采用PCR方法从美国红鱼肝脏中扩增出美国红鱼生长激素基因。该基因序列长为1 497 bp,与5个已报道的鲈亚目鱼类生长激素基因结构比较发现,他们的外显子和内含子之比均为6∶5,而且相对应的6个外显子大小一致。用Clustal X软件对美国红鱼和其他13种鲈形目鱼类生长激素基因序列进行比对,选取同源性较高的551 bp的编码区序列构建NJ和MP系统进化树,结果发现由其构建的MP和NJ树与根据形态特征构建的系统发育树基本一致,特别是在鲈形目鱼类科间及科以上分类阶元的系统发育研究方面比较一致。研究结果表明鱼类生长激素基因序列能够较真实反映近缘鱼类之间的关系,是进行鲈形目鱼类系统进化分析的较好遗传标志。     

甲醛致大鼠鼻腔癌与K-ras癌基因活化相关

为探讨甲醛致大鼠鼻腔癌的分子机制,对甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中的转化序列进行检测.采用的实验方法,包括肿瘤细胞DNA与选择标志基因(neo)共转染、裸鼠成瘤性分析、Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)和序列分析等.结果发现:在第二轮裸鼠肿瘤DNA中含有大鼠源性的K-ras基因序列,而无大鼠源性的H-ras、N-ras和p53基因序列.这表明甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中所含的转化序列与H-ras、N-ras及p53基因无关,K-ras癌基因的活化可能参与甲醛致大鼠鼻腔癌.     

激素和活性多肽

<正> 牲畜类(似于)生长激素的多肤(Ⅰ)之生产过程是将含为多肤(Ⅰ)编码的DNA序列与另一表达控制序列相连,这种重组DNA分子转化大肠杆菌宿主并进行梵养。为多肚(Ⅰ)编码的DNA序列较成熟的牲畜生长激素编码跳DNA序列以班阶了末     

大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的研制

针对近年来由虹彩病毒所引起的海水养殖鱼类疾病呈日趋严重的态势,该文在证实了引发我国大黄鱼大规模流行病的病原为一种虹彩病毒及测定病毒全基因组序列(111,760bp;GenBank accession numberl．AY779031)的基础上,通过与已报道虹彩病毒核酸序列进行分析比较,结合生物信息学手段,确定了以虹彩病毒ATPase基因保守区序列(295bp)作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,通过改进PCR模板的制备方法和优化扩增条件,建立了大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,模板制备时间约30min、回收率为52％、半个工作日即可得到准确的结果,无非特异性扩增带,适用于大黄鱼虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种的检疫及水质环境的监测,目前正在推广应用。     

Cloning and Sequencing of the Growth Hormone Gene of Large Yellow Croaker and Its Phylogenetic Significance

Using conserved primers and the PCR reaction, the growth hormone (GH) gene and the 3'-UTR of the large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) were amplified and sequenced. The gene structure was analyzed and compared to the GH genes of 5 other percoid fish downloaded from Genbank. Also the GH gene of the large yellow croaker and the genes from 14 Percoidei and 2 Labroidei species were aligned using Clustal X. A matrix of 564 bp was used to construct the phylogenetic tree using maximum parsimony and neighbor-joining methods. Phylogenetic trees by the two methods are identical in most of the clades with high bootstrap support. The results are also identical to those from morphological data. In general, this analysis does not support the monophyll of the families Centropomidae and Carangidae. But our GH gene tree indicates that the representative species of the families Sparidae and Sciaenidae are a monophyletic group.     

大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用

用甲醛灭活哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）GYC1108-1制备免疫原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经2－3次亚克隆后,共获得5株针对GYC1108-1的单克隆抗体。选取1B7制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为1∶3200和1∶32000。同样用灭活的哈维氏弧菌免疫新西兰大白兔,5次免疫后颈动脉采血,离心取血清,并用饱和硫酸铵法进行纯化,制备了兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体,其ELISA效价为1∶51200。利用1B7单克隆抗体和兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体以及山羊抗小鼠HRP酶标二抗,建立了检测哈维氏弧菌的三抗体夹心酶联免疫吸附试验（TAS-ELISA）方法。该方法对哈维氏弧菌的最小检出浓度为1×104个/mL。用该TAS-ELISA方法检测大黄鱼（Pseudosciaena crocea）样品,54尾患病大黄鱼中有45尾检出哈维氏弧菌,而14尾健康大黄鱼都没有检出哈维氏弧菌。由此可见,本试验建立的TAS-ELISA方法,可以用于患病大黄鱼哈维氏弧菌的快速诊断。     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆表达及免疫原性

根据实验室分离的大黄鱼弧菌病主要病原菌哈维氏弧菌(Vib rio harveyi)GYC1108-1株的胞外蛋白酶基因序列,设计胞外蛋白酶基因(ΔProA)特异性引物,扩增获得1552bp的ΔProA基因,克隆于pUC57-T载体;将ΔProA基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,ΔProA融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,分子量大小约55kD,诱导5h的表达蛋白产量约占细菌总蛋白的21%。Western blot分析,表达的55kD蛋白具有较高免疫原性。用纯化的ΔProA融合蛋白对大黄鱼进行免疫试验,结果免疫保护率达到75%。       

Characterization of OmpK, GAPDH and their fusion OmpK-GAPDH derived from Vibrio harveyi outer membrane proteins: their immunoprotective ability against vibriosis in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)

AIM: To investigate the immunoprotection of three recombinant proteins derived from the Vibrio harveyi outer membrane proteins (OMPs) OmpK, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and their fusion OmpK-GAPDH as vaccine candidates from vibriosis of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea). METHODS: The ompK gene, of which the leader sequence was omitted, was fused with the gapdh gene. Three recombinant proteins r-OmpK, r-GAPDH and r-OmpK-GAPDH were expressed and purified. Western blots were carried out to detect the specificity of the antibodies raised against the recombinant proteins; Fish were immunized with recombinant proteins and challenged by native V. harveyi. The immunoresponse to the recombinant proteins were determined by ELISA and phagocytic activity assay. CONCLUSIONS: The fusion protein r-OmpK-GAPDH can afford greater protection against the wild V. harveyi than r-OmpK or r-GAPDH alone or their mixture in humoral and cellular immunity, indicating that OmpK and GAPDH could produce a synergistic immunoprotection against vibriosis of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) when fused into OmpK-GAPDH with a linker. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: It has been realized that a multi-component OMP antigen can induce a higher frequency of immune effectors than a single OMP. The results presented here bring forth a good suggestion for the subunit vaccine design based on the OMPs of gram-negative pathogens.     

大黄鱼池塘不同混养模式生态学特征比较

利用菊花江蓠、双齿围沙蚕和大黄鱼在陆基围隔中构建鱼+藻(FG)、鱼+藻+沙蚕(FGP)以及鱼+沙蚕(FP)3种复合养殖模式,以单养鱼(F)模式为对照,探讨不同模式系统的沉积物、水体环境状况、养殖效益及氮、磷元素的回收效率.结果表明:菊花江蓠主要作用于系统水体中氮和磷的净化,具藻处理中氮、磷含量均显著低于无藻处理,对于水体环境中磷的利用效率达到投入量的33.8%～34.0%;沙蚕作用主要体现在对沉积物环境的改善,具沙蚕处理中氮、磷含量低于不具沙蚕处理,且在沉积物表层(1～2 cm)和次表层(2～4 cm)差异均显著.相对于F处理,FGP及FP处理总氮(TN)、总磷(TP)和无机磷(IP)分别下降了8.9%～9.2%、6.1%～6.3%和8.0%～8.1%.沙蚕对于沉积物中磷的回收达到投入量的7.5%～7.8%,有效减缓了磷在沉积物中的积累.FGP系统具有最佳的物质利用率及资源效益.     

Molecular cloning of leucocyte cell-derived chemotaxin-2 gene in croceine croaker (Pseudosciaena crocea)

Leucocyte cell-derived chemotaxin-2 (LECT2) was originally demonstrated to have a chemotactic activity against human neutrophils in vitro. Current evidence suggests that LECT2 may be a multifunctional protein involved in cell growth, differentiation and autoimmune. A full-length cDNA clone of the LECT2 gene, 595bp in size, was isolated from the fish croceine croaker (Pseudosciaena crocea). It's 3'-UTR was much shorter (112nts) than that of trout LECT2 gene (210nts). Its deduced amino acid sequence of 151 residues had 39.7-75.5% identity to that of other animals. Phylogenetic analysis shows that croceine croaker LECT2 (pLECT2) is clustered tightly with other fish LECT2. The relationships of the different LECT2 coincided well with the evolutionary relationships of their organisms. In healthy fish, the expression levels of pLECT2 gene from different tissues were similar, while that in Vibrio alginolyticus-infected fish were significantly increased in liver and spleen comparing to those in healthy fish, and were a little higher in the other tissues.     

岱衢族大黄鱼种质的AFLP分析

根据耳石年轮确定作为研究材料的浙江海区捕捞野生大黄鱼为岱衢族大黄鱼,并用AFLP技术进行种质分析。结果表明岱衢族大黄鱼可分为两类:岱衢族大黄鱼Ⅰ型和岱衢族大黄鱼Ⅱ型,这种划分与文献报道的岱衢族大黄鱼有“春综”和“秋综”两种群之分相吻合。岱衢族大黄鱼Ⅰ型生长速度比岱衢族大黄鱼Ⅱ型要快,海水养殖开发和利用岱衢族大黄鱼应选用岱衢族大黄鱼Ⅰ型作为亲本较好。获得的岱衢族大黄鱼种质AFLP指纹图谱,可以作为鉴定岱衢族大黄鱼的依据。       

黄姑鱼（ Nibea albiflora） 与大黄鱼（ Pseudosciaena crocea） 精子超微结构的观察与比较

应用扫描电镜（SEM）与透射电镜（TEM）观察了黄姑鱼和大黄鱼精子的超微结构。结果显示,黄姑鱼和大黄鱼精子无论在形态、大小还是超微结构上都十分相似。黄姑鱼和大黄鱼精子均由头部、中段和尾部（鞭毛）3部分组成。精子头部形状近似椭圆形,无顶体,细胞核呈肾形。中心粒复合体位于细胞核背侧,近、远端中心粒相互垂直,远端中心粒分化成基体并形成轴丝。中段的袖套呈筒状,4～5个圆形的线粒体围绕轴丝呈环形排列。精子尾部为单鞭毛,轴丝为典型“9＋2”结构,鞭毛表面质膜形成不规则侧鳍。     

舟山渔场主要渔业资源利用现状

用主成分分析对我国舟山渔场9个主要渔业种类的资源变动特征和利用现状进行了研究．结果表明,大黄鱼、小黄鱼等9种主要渔业资源可分为已经衰退的资源、已经充分利用的资源、处于利用中期的资源和开发期的资源4类．大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、墨鱼(Sepiella maindroni rochebrune)已进入衰退期;带鱼(Trichiurus haumela)、鲐鱼(Pneumatophorus japonicus,Decapterus maruadsi)已处于充分利用期;鳗鱼(Muraenesax cinereus)、小黄鱼(Pseudosciaena polyactis)和鲳鱼(Pampus)正处于增长期;虾蟹类处于开发期．因此,根据资源的现状,合理地开发利用渔业资源是我国海洋渔业资源可持续利用的关键．