Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

斑马鱼心脏标志基因TNC多克隆抗体的制备及表达研究

TNC是心脏发育的标志基因,但该基因在斑马鱼中的表达尚未研究。斑马鱼TNC基因基因的开放阅读框含有5132bp,编码1710个氨基酸,采用生物信息学结合PCR的方法获得了斑马鱼TNC基因的片段。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒（pGEX-4T-1-TNC）转化大肠杆菌BL21;通过IPTG诱导表达GST—TNC融合蛋白,通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot和免疫组化分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。利用该抗体进行斑马鱼胚胎抗体染色分析表明,TNC蛋白在心脏组织中特异表达。     

myh6蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中,myh6编码是一种促进心室心肌细胞扩张的转录因子。为了进一步研究myh6在心脏发育和心脏疾病发生中的功能,需要获得斑马鱼myh6蛋白并制备其抗体。从斑马鱼心脏组织中提取总RNA,通过反转录得到心脏组织特异表达基因的cDNA,PCR扩增得到myh6部分编码区序列,然后将其连接到pGEx_4T载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的特异性。结果显示,获得了myh6原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗myh6多克隆抗体,为myh6功能的进一步研究提供了有力的工具。     

斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。     

斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因（z—lefty1）的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒（pGEX／z-Lefiy1）转化入BI21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST—z—Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z—Lefiy1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。     

斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体的制备及检测

Foxp4为Fox基因家族的一员,目前研究发现其与肺、肠、心脏以及中枢神经系统的发育有关.为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体.按照巢式PCR原理,经过两次PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Foxp4基因片段,将其克隆人表达载体pGEX4T-1,转化至大肠杆菌BL21中,再通过1PTG进...     

人类心脏和肌肉组织特异表达基因Smyd1的表达与抗体制备

Smydl基因是人类心脏和肌肉特异表达基因．制备该基因的多克隆抗体可以为进一步深入研究Smydl在心脏发育过程中与其他因子相互作用提供检测工具．通过PCR方法扩增smydl基因的编码区片段．并将其克隆至PGEX-4T-1上,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过5052法和IVrG法分别诱导表达GST-Smydl融合蛋白．经比较,5052法诱导的蛋白表达量明显高于IPTG法．采用5052法大量诱导表达,通过割胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Westernblot检测抗体活性．结果表明。实验获得了高质量的多克隆抗体．     

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明：该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。     

斑马鱼心脏发育标记基因Wnt11的多克隆抗体制备

Wnt11为Wnt家族的成员,是参与Wnt信号途径调控的转录因子,对心脏的正常发育起着非常重要的作用.根据已报道的Wnt11基因序列,通过RT-PCR从斑马鱼心脏组织中得到Wnt11部分编码区序列,将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体上.经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功,将重组质粒(pGEX-4T-Wnt11)转化E.coli BL2l,通过IPTG诱导表达出融合蛋白,采用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化.将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Wnt11原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Wnt11多克隆抗体,为Wnt11功能的进一步研究奠定了基础.     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。     

盘状结构域受体2胞外区的可溶性表达、纯化和功能鉴定

盘状结构域受体2（discoidin domain receptor 2,DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酷氨酸激酶,其配体为纤维性胶原,胶原对DDR2的活化上调细胞中基质金属蛋白酶1（MMP－1）的表达。为研究DDR2在类风温性关节炎(rteumatoid arthritis,RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用,尝试了在大肠杆菌中表达一段DDR2胞外区（命名DB）,并进行了可溶性部分的纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂。获得了一株表达GST－DB融合蛋白的大肠杆菌克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的13％;经GST融合蛋白特异性亲和珠纯化后,获得了纯度约86.1%的可溶性GST－DB融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,GST－DB具有阻断Ⅱ型胶原和细胞表面天然DDR2受体结合的功能;细胞实验表明,GST－DB有抑制Ⅱ型胶原刺激下的类风湿性关节炎滑膜细胞和NIH3T3细胞分泌MMP－1的作用。以上结果提示,表达的融保蛋白GST－DB具有抑制天然DDR2功能的作用;DDR2在滑膜细胞和NIH3T3细胞中介导Ⅱ型胶原刺激下的MMP－1的分泌。     

庚型肝炎病毒E2区cDNA在毕赤酵母中的表达及抗原性鉴定

从含有庚型肝炎病毒(GBVC/HGV)包膜蛋白E2 cDNA(559bp)的质粒pGEX\|E2中,扩增得到能够编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(GST)和GBVC/HGV包膜蛋白E2的融合基因片段。将此长度为1324bp的DNA片段插入到酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α因子信号肽下游,且与之同框。通过电激转化将构建的重组表达质粒pPIC9K\|GST\|E2插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中。筛选His\++Mut\+s表型的转化子,震荡培养,用05%甲醇诱导表达5d后,在培养液中得到表达的GSTE2融合蛋白。经过表达条件的优化,GSTE2蛋白可占培养液中总蛋白的50%。通过谷胱甘肽亲和层析柱纯化,GSTE2融合蛋白的纯度可达95%左右。以庚型肝炎病人血清为探针,进行免疫印迹及ELISA实验,结果表明该融合蛋白具有能被庚型肝炎病人血清特异性识别的抗原性。     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

津田芜菁MYB77蛋白的原核表达及纯化

目的:建立津田芜菁转录因子MYB77的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:RT-PCR获得MYB77的编码序列,将其克隆至pGEM-T载体中,在上下游引物中分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,PCR获得带酶切位点的目的片段并将其连接到重组表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌DE3工程菌株,IPTG诱导重组质粒pGEX-KG-MYB77在大肠杆菌DE3中表达带有GST标签的融合蛋白,超声裂解大肠杆菌,用MagneGST ProteinPurification System纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE和Western印迹验证GST-MYB77融合蛋白的表达。结果:重组菌株可以表达GST-MYB77融合蛋白,用Western印迹鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为55.56×103处检测到目的条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-MYB77融合蛋白,为进一步研究津田芜菁MYB77蛋白的功能奠定了基础。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

大鼠Notch 1胞质段的克隆及其表达

Notch 1信号途径参与决定细胞命运,其水解后产生的活性片段——胞质段（Notch 1 intracellular cytoplasmic domain, NICD）能被转运进核,激活下游靶基因的表达.Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程.为了获得重组的NICD,以大鼠脑cDNA文库为模板,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段,克隆至谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合表达载体pGEX-KG中,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达.表达的融合蛋白GST-NICD分子质量约为120 ku左右,以包涵体和可溶性两种形式存在,易于亲合层析纯化.为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础.     

血管抑制素功能结构域K1与PKA底物磷酸化基序的融合表达及磷酸化标记

通过 RT- PCR,从人肝组织中扩增出血管形成抑制素 ( angiostatin) c DNA的 K1片段 ,经DNA序列分析证实其正确性 ;将 K1与 GST融合并带上 1 7个氨基酸的 PKA底物磷酸化基序 ,IPTG诱导表达 ,以还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶亲合层析直接从细菌裂解上清中纯化融合蛋白 ;以 PKA催化单位将 3 2 P通过磷酸化作用标记至纯化的蛋白 ,再用凝血酶切去 GST,进行SDS- PAGE.放射自显影结果显示 ,GSTag- K1和 Tag- K1分别在 40 k D和 1 7k D处有信号强而特异的显影条带 ,表明带有磷酸化序列的蛋白能够被 PKA特异地磷酸化标记     

庚型肝炎病毒NS5 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为880 bp的庚型肝炎病毒cDNA在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达。此cDNA被插入到表达质粒pGEX-5X-1中,位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的DNA序列下游,并与GST处于同一阅读框。用乳糖在37℃下诱导表达出以包涵体形式存在的GST-NS53融合蛋白,并用脲溶法提取了该蛋白;在20℃诱导时,表达出的蛋白大部分可溶,用谷胱甘肽Sepharose-4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹实验证明,此融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清和自制的抗GST血清特异性地识别。用PCgene软件对NS53氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析。本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。