蛋白凝胶基质的制备与基质内的血管生成反应

利用肝素亲和层析从血清中提取玻璃粘连蛋白（vitronectin）,以硫酸铵沉淀法从血浆中粗提含纤维蛋白原的复合蛋白质组分,向血浆蛋白、胎牛血清和DMEM组成的复合成分中加入凝血酶,制成蛋白质凝胶.观察血管内皮细胞在此基质上或在基质中的生长及在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的诱导下形成的血管样结构.结果表明血管内皮细胞可粘附在此凝胶基质表面正常生长,在bFGF的诱导下,内皮细胞向胶内迁移、生长并形成管状结构,多个管状结构连接、融合形成毛细血管网状结构.     

靶向性DNA甲基化酶在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的：在毕赤酵母中表达融合Myc—His标签的靶向性甲基化酶B1—3a并进行鉴定。方法：以含有B1—3a基因的pcDNA4．0-myc／his质粒为模板,通过PCR扩增获得融合有myc／his标签序列的目的区段B1—3a基因,然后克隆入表达载体pPIC3-5k;电穿孔转化毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS—PAGE和Western印迹对表达产物进行鉴定。结果：表达产物中可见与目的蛋白相对分子质量（50000）相符的条带,该条带可被Myc标签单克隆抗体特异识别。结论：正确构建了靶向性甲基化酶Bl-3a的酵母表达载体,靶向性甲基化酶能够在毕赤酵母中成功表达。     

血管生长抑素在小鼠胚泡中的调节作用

血管生长抑素（angiostatin,AS）是一种新血管生成的抑制蛋白,它可以有效抑制内皮细胞的增殖、迁移和管状形态的产生,是肿瘤转移的有效抑制剂.肿瘤转移和胚胎植入具有惊人的相似性,AS对小鼠胚胎植入是否有作用迄今尚无报道.采用体外培养、RT-PCR和蛋白质印迹等多种方法研究了AS对小鼠胚泡中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体KDR、基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)的影响.研究显示,AS下调了VEGF及其受体KDR、MMP-2和MMP-9的表达,而上调了TIMP-1和TIMP-2的表达.应用整合素αVβ3的特异性抑制剂Echistatin与AS共同处理胚泡,结果显示,Echistatin减弱了AS对MMP-2的下调作用及对TIMP-2的上调作用.以上结果提示：AS可能通过与整合素αVβ3相互作用调节胚泡中VEGF、MMPs和TIMPs的表达,从而影响胚泡的植入过程.     

血管抑制素功能结构域K1与PKA底物磷酸化基序的融合表达及磷酸化标记

通过 RT- PCR,从人肝组织中扩增出血管形成抑制素 ( angiostatin) c DNA的 K1片段 ,经DNA序列分析证实其正确性 ;将 K1与 GST融合并带上 1 7个氨基酸的 PKA底物磷酸化基序 ,IPTG诱导表达 ,以还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶亲合层析直接从细菌裂解上清中纯化融合蛋白 ;以 PKA催化单位将 3 2 P通过磷酸化作用标记至纯化的蛋白 ,再用凝血酶切去 GST,进行SDS- PAGE.放射自显影结果显示 ,GSTag- K1和 Tag- K1分别在 40 k D和 1 7k D处有信号强而特异的显影条带 ,表明带有磷酸化序列的蛋白能够被 PKA特异地磷酸化标记     

靶向性甲基化酶真核表达载体pcDNA3.1-myc-3a的构建

目的:在pcDNA3.1真核表达载体中构建表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a并进行鉴定。方法:以含有myc全长基因的pcDNA3.1-myc-Luc质粒为模板,通过PCR方法扩增获得myc(DBD),再以含有靶向性甲基化酶的pcDNA4.0-GBD-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段3a,然后将两者克隆入表达载体pcDNA3.1;以双酶切和PCR方法对构建的载体进行鉴定。结果:通过PCR方法获得了靶向性甲基化载体pcDNA3.1-myc-3a,并通过免疫印记方法验证了抗myc标签抗体可以特异性识别目的蛋白。结论:正确构建了靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a的真核表达载体。     

一步法从人血浆中制备天然血管生成抑制素

血管生成抑制素（angiostatin）能特异地抑制新生血管生成,有潜在的临床应用价值.利用亲和层析从人血浆中纯化纤溶酶原,并在原位进行弹性蛋白酶有限消化产生angiostatin片段,经过洗涤,然后用0.2 mol/L 6-氨基己酸溶液将angiostatin特异性洗脱.此改进使整个制备过程变得简单、快速和高效.体外对牛主动脉内皮细胞的生长抑制实验以及体内鸡胚尿囊膜血管生成抑制分析结果证实所制备的angiostatin有较强的抑制血管生成活性.     

靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。