gcm蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

gcm(glial cells missing)是调控神经元细胞和神经胶质细胞相互转化的一个基因开关.在gcm功能缺损的突变体中,预期的神经胶质细胞发育成神经元细胞;而在gcm过表达的突变体中,预期的神经元细胞转化为神经胶质细胞.此外,gcm还调控血浆细胞发育.为了进一步研究gcm在发育中的功能,需要获得gcm蛋白并制备其抗体.根据已报道的gcm基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增得到gcm部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体以获得原核表达载体.重组载体经酶切测序鉴定确认后,转化大肠杆菌(E.coli)BL21,并用IPTG诱导融合蛋白表达.采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化蛋白,将纯化的His-gcm融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价.获得的gcm原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗gcm多克隆抗体,为gcm功能的进一步研究奠定了基础.     

果蝇唾液腺特异基因CG8419多克隆抗体的制备及检测

果蝇CG8419基因与脊椎动物中TRIM45基因为同源基因.以果蝇cDNA为模板通过PCR扩增出亲水性和特异性好的果蝇CG8419基因片段,将其克隆入表达载体PET-28a,构建出重组表达质粒PET-28a-CG8419.将重组质粒转化大肠杆茵Rosetta,经IPTG诱导出带His标签的重组融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.Western blot实验分别验证抗体的效价和特异性.果蝇胚胎抗体染色显示该基因在果蝇唾液腺中表达.     

小鼠 LRRC 10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

目的：构建含有小鼠Lrrc10（Leucine-rich Repeat Containing protein 10）基因的重组腺病毒表达载体。方法：设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18 T载体。测序后,用Sal Ι和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果：用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论：小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。     

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明：该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。