果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

斑马鱼心脏标志基因TNC多克隆抗体的制备及表达研究

TNC是心脏发育的标志基因,但该基因在斑马鱼中的表达尚未研究。斑马鱼TNC基因基因的开放阅读框含有5132bp,编码1710个氨基酸,采用生物信息学结合PCR的方法获得了斑马鱼TNC基因的片段。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒（pGEX-4T-1-TNC）转化大肠杆菌BL21;通过IPTG诱导表达GST—TNC融合蛋白,通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot和免疫组化分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。利用该抗体进行斑马鱼胚胎抗体染色分析表明,TNC蛋白在心脏组织中特异表达。     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

RMNDSA通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.通过PCR扩增RMND5A基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过IPTG进行诱导表达GST-RMND5A融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果说明,获得了RMND5A原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗RMND5A多克隆抗体,为RMND5A进一步的功能研究奠定了基础.     

Ataxin-3融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的:表达GST-ataxin-3-N融合蛋白并制备GST-ataxin-3特异性抗体,为深入研究其功能及其在SCA3发病机制中的作用提供重要的技术和材料保障.方法:将人ataxin-3氨基端基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,用Glutathione sepharose4B凝胶亲和柱纯化目的蛋白.利用纯化的GST-ataxin-3-N蛋白制备多克隆抗体.结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-ataxin-3-N融合蛋白.以融合蛋白免疫新西兰兔得到Ataxin-3-N多克隆抗体,Western Blotting及免疫荧光均证实该抗体能够识别Ataxin-3-myc蛋白,具有较高特异性.结论:利用原核表达人GST-ataxin-3-N融合蛋白制备的Ataxin-3多克隆抗体具有较好的特异性,可用于该蛋白的相关研究.     

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。     

斑马鱼ANF基因的克隆及多克隆抗体的制备

心房钠尿肽ANF是钠尿肽家族中的一员,是心肌细胞分泌的一种循环激素,主要在心房组织分泌。生物信息学分析表明,斑马鱼ANF基因开放阅读框全长321bp,编码106个氨基酸,PCR扩增获得斑马鱼ANF基因全长。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-ANF)转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导表达GST-ANF融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。     

斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因（z—lefty1）的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒（pGEX／z-Lefiy1）转化入BI21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST—z—Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z—Lefiy1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。     

Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表达与鉴定

33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒(fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。     

新型转录因子MDFIC的原核表达及多克隆抗体制备

小鼠MDFIC(MyoD family inhibitor domain containing) 蛋白是一个新近发现的与HIC(Human I-mfa domain containing protein)高度同源的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中起着重要的作用。为了深入研究MDFIC的功能,首先要制备抗MDFIC的多克隆抗体。首先采用PCR方法扩增出编码MDFIC的cDNA片段,然后将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-3, 并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE 和Western blotting 检测鉴定表达产物。亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价达1∶640 000以上,检测证明抗体效价较高。此外, Western blotting结果显示, 该抗体可特异性识别真核细胞外源性及内源性的MDFIC蛋白。MDFIC多克隆抗体的成功制备为进一步研究MDFIC的功能以及进一步探索肌细胞的发生分化机制提供了重要工具。     

Wnt11-R, a protein closely related to mammalian Wnt11, is required for heart morphogenesis in Xenopus

Wnt11 is a secreted protein that signals through the non-canonical planar cell polarity pathway and is a potent modulator of cell behavior and movement. In human, mouse, and chicken, there is a single Wnt11 gene, but in zebrafish and Xenopus, there are two genes related to Wnt11. The originally characterized Xenopus Wnt11 gene is expressed during early embryonic development and has a critical role in regulation of gastrulation movements. We have identified a second Xenopus Wnt11-Related gene (Wnt11-R) that is expressed after gastrulation. Sequence comparison suggests that Xenopus Wnt11-R, not Wnt11, is the ortholog of mammalian and chicken Wnt11. Xenopus Wnt11-R is expressed in neural tissue, dorsal mesenchyme derived from the dermatome region of the somites, the brachial arches, and the muscle layer of the heart, similar to the expression patterns reported for mouse and chicken Wnt11. Xenopus Wnt11-R exhibits biological properties similar to those previously described for Xenopus Wnt11, in particular the ability to activate Jun-N-terminal kinase (JNK) and to induce myocardial marker expression in ventral marginal zone (VMZ) explants. Morpholino inhibition experiments demonstrate, however, that Wnt11-R is not required for cardiac differentiation, but functions in regulation of cardiac morphogenesis. Embryos with reduced Wnt11-R activity exhibit aberrant cell-cell contacts within the myocardial wall and defects in fusion of the nascent heart tube.     

人类心脏和肌肉组织特异表达基因Smyd1的表达与抗体制备

Smydl基因是人类心脏和肌肉特异表达基因．制备该基因的多克隆抗体可以为进一步深入研究Smydl在心脏发育过程中与其他因子相互作用提供检测工具．通过PCR方法扩增smydl基因的编码区片段．并将其克隆至PGEX-4T-1上,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过5052法和IVrG法分别诱导表达GST-Smydl融合蛋白．经比较,5052法诱导的蛋白表达量明显高于IPTG法．采用5052法大量诱导表达,通过割胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Westernblot检测抗体活性．结果表明。实验获得了高质量的多克隆抗体．     

miR-22心肌特异转基因斑马鱼的构建及心肌肥厚的评估

目的:构建miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,在体评估miR-22对于心肌肥厚的作用。方法:构建pTol2-CMLC2-miR-22-IRES-EGFP表达载体。通过显微注射的方法将tol2重组质粒于一细胞期注射入斑马鱼受精卵胚胎中,荧光筛选获得心肌特异表达绿色荧光的斑马鱼胚胎,并稳定表达传代。然后对稳定传代的成年斑马鱼心脏进行心肌肥厚及心功能的检测。结果:成功建立了miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,通过定量PCR确定心肌中miR-22表达升高,荧光显微镜观察发现斑马鱼心肌出现绿色荧光。miR-22心脏特异过表达的转基因鱼系的成年鱼与野生对照组相比,出现了心肌肥厚的现象,心肌肥厚分子标志物nppa、myh7明显升高。斑马鱼心脏病理切片结果同样显示出miR-22心肌特异转基因斑马鱼出现了心肌肥厚的现象。结论:成功构建了miR-22心肌特异转基因斑马鱼,为研究心肌中miR-22的生物学功能提供了重要的工具,并证明miR-22心脏特异过表达会引起斑马鱼心肌肥厚。