钝顶螺旋藻SP1(Spirulina platensis)对集约化养殖尾水氮磷的去除效果

针对集约化养殖模式后期硝酸盐氮和磷酸盐浓度较高的问题, 实验设置生物絮团养殖尾水(BFW)和BG11培养液(BGW)两种水体环境, 并以池塘常见优势微藻--绿色颤藻OC1(Oscillatoria chlorina)作为对比, 研究分析了钝顶螺旋藻SP1(Spirulina platensis)对集约化养殖尾水氮磷的去除效果及其生长状况。结果发现, 在BFW组中两种微藻均对硝酸盐氮(NO3--N)、总无机氮(TIN)和磷酸盐(PO43--P)去除效果明显(P<0.05), 其中, 螺旋藻对NO3--N、TIN和PO43--P的最大去除率分别为79.60%、46.06%和98.55%, 相应的浓度值分别从130.04 mg·L-1、130.85 mg·L-1和10.23 mg·L-1降至26.53 mg·L-1、70.58 mg·L-1和0.15 mg·L-1,其数量降低的绝对值分别为103.51 mg·L-1、60.27 mg·L-1、10.08 mg·L-1; 在BGW组中两种藻对氮磷均具有一定的去除效果, 但总体仍低于BFW组。实验过程中两种微藻的细胞数量均无明显变化(P>0.05)。可见, 钝顶螺旋藻SP1和绿色颤藻OC1均可在BFW和BGW两种水体营养环境下存活, 且对水中的氮磷均有良好的去除效果; 虽然颤藻亦是集约化养殖水环境中的常见微藻优势种, 但它能分泌蓝藻毒素, 因此, 从产业应用的可行性考虑可将螺旋藻作为集约化养殖尾水净化的备选藻株。     

流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得

根据JEV病毒减毒株SA14—14—2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT—PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR—kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT—PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。     

大肠杆菌重组工程

源于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统不需要限制性内切酶和DNA连接酶就可以进行DNA克隆和亚克隆,还能快速地改造质粒、细菌人工染色体及细菌基因组染色体,是基因工程技术的一大突破,被称为重组基因工程或重组工程。该技术操作简单,效率较高,可望为功能基因组学研究提供一个有力的工具。     

养殖中后期高位池对虾水体微生物群落结构及水体理化因子

针对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高位池越冬棚养殖模式,采集养殖中后期水样,分析水体微生物群落结构、优势菌种类和水体理化因子的动态变化。结果表明:越冬棚保温效果良好,池塘水温由搭棚前最低的20.6℃上升并维持稳定于26.5℃左右,可满足对虾正常生长需求;养殖中后期水体异养细菌数量在5.10×104~2.95×105cfu·m L~(-1)波动,菌群结构相对稳定,优势菌数量在养殖后期略有增加;嗜冷杆菌(Psychrobacter)、亚硫酸杆菌(Sulfitobacter)等在养殖中后期均为优势种,搭棚后黄杆菌(Flavobacteria)、生丝微菌(Hyphomicrobium)等形成优势;亚硝氮、硝氮和水温是影响养殖中后期水体微生物群落分布的主要理化因子。研究表明,搭建越冬棚有利于保持养殖池塘水环境的相对稳定,养殖中后期水体氮素水平的控制尤为重要。因此,为促进水中有益菌的生态优势,调控水体菌群结构和生态功能,建议在养殖中后期,尤其是搭建越冬棚前后合理使用益生菌制剂,净化水质,稳定生态环境。     

不同佐剂条件下Aβ多肽B细胞表位疫苗诱导产生抗体的免疫反应特性分析

目的:研究阿尔茨海默病β淀粉样肽(Aβ)B细胞表位疫苗2Aβ1-15-PADRE(Aβ-T)诱导产生抗体的免疫反应特性,并探讨不同佐剂对该疫苗免疫反应效果的影响。方法:合成了含2个Aβ42的 B细胞表位—Aβ1-15及1个辅助T细胞表位—PADRE的多肽2Aβ1-15-PADRE。采用Al(OH)₃佐剂,弗氏佐剂,Abisco佐剂,MF59佐剂分别与多肽疫苗联合免疫小鼠,并另设3个对照组:无佐剂多肽免疫组(Mock),PBS免疫组(PBS),未免疫组(Native)。结果:5组多肽免疫组小鼠均产生了针对Aβ的特异性抗体,无佐剂多肽免疫组的IgG抗体滴度最低,Al(OH)₃佐剂组,MF59佐剂组,Abisco佐剂组小鼠IgG抗体滴度较高,弗氏佐剂组IgG抗体滴度最高。斑点杂交实验结果显示5组小鼠免疫后血清与Aβ42单体反应较弱,与寡聚体反应最明显,与纤维状Aβ42几乎不反应。结论:4种佐剂均能提高多肽疫苗的免疫反应,产生高水平抗Aβ的特异性抗体。5组免疫小鼠产生的抗体均与Aβ寡聚体反应较强,与纤维状Aβ42反应较弱,表明该多肽疫苗具有良好的应用前景。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv—突变人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体,轻链可变区突变体-突变体hhTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子。结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,混合复合结果未获得活性产物。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv-突变体人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体、轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子.结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达.表达产物以包涵体形式存在,混合复性结果未获得活性产物.     

CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。     

用反式互补表达载体实现全抗体在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：通过弱化筛选基因二氢叶酸还原酶基因（dhfr）,构建双顺反子全抗体表达载体,实现全抗体在CHO细胞中的高效表达。方法：将dhfr基因分为分别编码1-105和106～187氨基酸残基的2部分,分别通过linker与亮氨酸拉链GCN4融合,分别通过内部起始位点序列与抗体轻重链基因偶联,构建成2个双顺反子表达载体pIRESLZdhfr—H和pIRESLZdhfrL。用脂质体2000转染CHO-dhfr-细胞,用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的IMDM筛选培养基筛选阳性克隆。结果：筛选到的阳性克隆表达水平为1．47-3．5μg／（106细胞·d）,经氨甲蝶呤（MTX）梯度加压,在MTX浓度为5×10^-8mol／L时,表达水平达到11．5μg／（10^6细胞·d）。结论：构建了基于亮氨酸拉链二聚化基础的dhfr弱化方式的双顺反子表达载体,实现了全抗体在CHO—dhfr-细胞中的高效表达。     

噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展

噬菌体展示技术已成为制备高亲和力抗体的强有力的工具。而噬菌体抗体库的筛选是在获得高亲和力抗体过程中很关键的一个环节。总结了针对不同复杂程度的抗原所须采用的不同筛选方法,并简单介绍了高通量筛选的优势。