奶山羊β-乳球蛋白基因5''、3''调控区的克隆和序列分析

目的:克隆奶山羊β-乳球蛋白(BLG)基因5'、3'调控区,并对其进行序列分析.方法:从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到奶山羊BLG基因4.2 kb的5'调控区和1.8 kb的3'调控区;将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性.结果:部分序列分析表明,奶山羊BLG基因5'区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5'区的同源性分别为100%和95%,3'区的同源性分别为99%和93%;克隆得到的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同,二者5'区和3'区的同源性分别为83%和88%.结论:克隆得到的奶山羊BLG基因调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,用于外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达.     

牦牛BLG基因5'调控成分的克隆及序列分析

目的:克隆牦牛β-乳球蛋白(BLG)基因5'调控成分(3.5kb).方法:利用PCR方法克隆了牦牛BLG基因5'侧翼区,并进行生物信息学分析表明.结论:获得了3.5kb的BLG基因5'调控成分,其中包括5'侧翼区(2 472bp),第一外显子及第一内含子(1 066bp).该序列与牛、绵羊和山羊的同源性分别为98.42%、89.61%和84.41%;平均GC含量为49.3%;存在一个CpG岛;可能存在一个启动子位点,位于起始密码子前-83bp处;AliBaba2.1分析发现该区域有47种潜在的转录因子结合位点,其中包括乳蛋白结合因子(MPBF)、乳腺活化因子(MAF)、糖皮质激素受体(GR)、雌激素受体(ER)、核因子1(NF-1)等结合位点,提示该调控成分可用于构建乳腺特异性表达载体.结果:成功克隆出BLG基因5'侧翼区,为构建转基因牦牛乳腺生物反应器的特异性表达载体奠定基础.     

牛β-酪蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分别克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特异性表达载体：利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区（6．8kb）,第3段和实验室已有的600bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区（3．4kb）构建了一乳腺特异性表达载体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。     

牛BLG基因5＇调控成分的克隆和制备乳腺生物反应器研究

用PCR法克隆了牛β-乳球蛋白(BLG)基因的 1个片段,它包括 650 bp的 5’侧翼序列,第一二外显子和第一内含子.以该片段中的 650 bP的侧翼序列及转录起始位点下游 11 bP的非编码区(共 661 bP)作为调控序列,与人生长激素(hGH)基因构建成了表达载体,在培养的原代山羊乳腺上皮细胞中进行暂时表达,结果在激素诱导下, hGH基因能够表达,并且表达产物的绝大部分分泌到培养基中.将上述表达载体中的BLG/hGH融合基因部分经显微注射法制得5只转基因阳性小鼠,其中1只小鼠乳清中hGH的含量为420 μg/mL而血清中仅为0.051μg/mL,说明本实验克隆的牛BLG基因5’调控序列可以控制目的基因在转基因动物中表达,基本上具有乳腺特异性,而且产物能分泌至乳汁中.     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素（TPO）的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5’端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和PlA3 3种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT〉pB3．9T〉pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5’端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。     

人乳铁蛋白cDNA 基因乳腺表达载体的构建与鉴定

为了构建人乳铁蛋白基因 (hLF) 的乳腺表达载体并验证其在乳腺细胞中的表达情况,本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5′端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3′部分基因组片段作为3′端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因 (目的基因) 和Neo基因 (筛选标记) 分别插入到5′端调控序列和3′端调控序列的下游,构建成pBC1-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

整合人lactoferrin基因的山羊体细胞支持核移植克隆胚的体外发育

克隆了人lactoferrin基因和山羊[[beta]]-casein基因5′端调控区, 构建了人lactoferrin的乳腺表达载体, 并将该载体利用脂质体介导转染了奶山羊胎儿成纤维细胞, 获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因体细胞克隆17个, 其中PCR和Southern Blot检测阳性的细胞克隆14个, 阳性率82.4%。以转基因体细胞为供体细胞进行了核移植, 获得了能够体外发育的山羊转基因克隆胚胎, 体内成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为64.8%, 体外成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为51.7%, 证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚的进一步发育。     

山羊β乳球蛋白基因的克隆及其在转基因小鼠乳汁中的高效表达 Goat β-lactoglobulin Gene Cloning and High Expression in the Mammary Gland of Transgenic Mice

通过长距离PCR从山羊基因组DNA分两段扩增山羊β乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）基因,扩增出的两个片段分别克隆到T载体上,利用BLG基因序列自身存在的NarI单酶切位点进行拼接,获得了全长为7.2kb的山羊BLG基因克隆,并构建了它的真核表达载体,经酶切鉴定和序列分析证实了克隆的正确性。用线性化的BLG基因显微注射小鼠受精卵以建立转基因鼠,经PCR和Southern印迹分析证实获得了6只首建者（Founder）转基因小鼠（3♀,3♂）,在泌乳期采集两只F0代转基因雌鼠乳汁并用ELISA测定山羊β乳球蛋白的含量,其表达水平分别为23.49 mg/mL和2.19 mg/mL。 Abstract:To clone goat β-lactoglobulin (BLG) gene,two fragments were amplified from goat genomic DNA by LD-PCR method.The fragments were inserted in T-vectors before being spliced into the whole 7.2 kb BLG gene at a single restriction enzyme site of NarI.Consequently,the eukaryotic expression vector was constructed.All the clones were proved to be correct by restriction enzyme cutting and sequencing analysis.Six Founders (3♀,3♂) of goat BLG transgenic mice were obtained by microinjection and BLG genes integration were confirmed by both PCR and Southern blot analyses.The milk was collected from two lactating female transgenic mice and goat BLG protein contents were measured with ELISA.The results showed that goat BLG protein in milk of the two mice were 23.49 mg/mL and 2.19 mg/mL,respectively.     

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因启动子区的克隆、生物信息学分析及活性研究

根据已发表的β-酪蛋白基因全序列设计合成引物,以西农萨能奶山羊乳腺组织基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增β酪蛋白基因组基因5’侧序列。将该序列克隆入pMD18-T载体,并对其进行序列测定。结果克隆得到西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因-4 359至＋2 106共6465bp序列。该序列保留β-酪蛋白第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分。将该序列与已公布的其他山羊β-酪蛋白基因序列进行比较,其同源性为96％-98％。生物信息学分析显示,β-酪蛋白基因启动子区包含有TATA启动子序列和HOXF、Oct-1、AP1、CEBP、STAT、NFKB、GR、ER、PR和ETS等转录因子识别位点。将此6 465bp片段插入荧光素酶报道基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3／B65,瞬时转染萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞48h后检测显示,该假设的启动子区确有启动子功能,对泌乳激素发生反应。本研究为进一步构建有效的乳腺生物反应器载体奠定了基础。     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL。这为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据。     

山羊与牛乳腺差异表达基因的筛选及半定量RT-PCR分析

山羊和奶牛具有非常相似的泌乳过程,但在产乳量和乳成分(脂肪和蛋白含量)之间存在很大的差异,而且山羊奶还具有特殊的膻味。本研究根据山羊和牛在基因编码序列上具有非常高的保守性原理,利用抑制消减杂交技术对3只西农萨能奶山羊和3头荷斯坦奶牛泌乳末期的乳腺组织进行差异表达基因分析。分别提取山羊和牛乳腺组织总RNA,分离mRNA并合成cDNA,以山羊乳腺组织cDNA作为测试,牛的乳腺组织cDNA作为对照。cDNA经RsaⅠ酶切后将测试组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆经PCR鉴定发现有150个克隆具有200bp-1000bp插入片段,挑选50个差异片段不等的克隆进行测序及同源性分析,结果得到5个已知乳蛋白(αs2酪蛋白、β酪蛋白、К酪蛋白、α乳清白蛋白和β乳球蛋白)基因的编码序列和6个新的EST序列,EST序列已登录GenBank,登录号分别为EG588067、EG588068、EG588069、EG588070、EG588071和EG588072。通过半定量RT-PCR分析,发现β酪蛋白基因mRNA表达量在山羊乳腺中显著高于其在牛乳腺中的表达量,К酪蛋白在乳腺中的mRNA含量与其所表达的蛋白质在乳中含量存在很大差异,表明К酪蛋白虽然和其他酪蛋白具有相同的调控机制,但其在分泌和运输机制上与其他酪蛋白不同。     

山羊β-casein位点打靶载体在乳腺上皮细胞中的表达研究

以本地山羊基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增出山羊β-casein上游包括启动子,外显子1及部分外显子2的6.1kb的调控序列及下游3.3kb的序列,将来自质粒pCDNA3的neo基因以及来自质粒pNEOZTK-2的tk基因,经克隆重组后构建了本地山羊乳腺特异性定点打靶载体,并在其中克隆人乳铁蛋白mini基因,采用脂质体法转染小鼠乳腺上皮癌化细胞系C127,以进行打靶载体的表达功能检测,双夹心ELISA测得诱导液中乳铁蛋白表达量为0.2μg/mL,Western-blot显示重组蛋白分子量比标准品略小,约为76kD,结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。     

牛αS1酪蛋白5′调控序列驱动报告基因 LacZ 在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

αS1酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白.本研究克隆了牛αS1酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,应用基因重组技术将其插入 lacZ 基因上游,构建真核表达载体gαs1p psv.胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光法鉴定了乳腺上皮细胞. 将重组载体转染奶山羊乳腺上皮细胞,在细胞培养液中,转染后24 h可以检测到 lacZ 基因的表达,之后表达水平有逐渐升高的趋势,72 h开始降低,144 h降到最低;在细胞破碎液中,转染后24 h表达水平最高,之后表达水平有逐渐降低的趋势,144 h降到最低.转染细胞的第1代表达水平最高,随细胞传代表达水平降低,传到第3代时基本检测不到表达产物. 对转染后的细胞进行了β 半乳糖苷酶原位细胞染色. 实验证明,得到的牛αS1酪蛋白5′调控序列能指导外源基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达.     

牛αS1酪蛋白5′调控序列驱动报告基因LacZ在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

αS1酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白.本研究克隆了牛αS1酪蛋白5′调控序列约1.2kb的片段,应用基因重组技术将其插入lacZ基因上游,构建真核表达载体gαs1p-psv.胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光法鉴定了乳腺上皮细胞.将重组载体转染奶山羊乳腺上皮细胞,在细胞培养液中,转染后24h可以检测到lacZ基因的表达,之后表达水平有逐渐升高的趋势,72h开始降低,144h降到最低;在细胞破碎液中,转染后24h表达水平最高,之后表达水平有逐渐降低的趋势,144h降到最低.转染细胞的第1代表达水平最高,随细胞传代表达水平降低,传到第3代时基本检测不到表达产物.对转染后的细胞进行了β-半乳糖苷酶原位细胞染色.实验证明,得到的牛αS1酪蛋白5′调控序列能指导外源基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达.     

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定.结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础.     

山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析

用LongPCR技术克隆山羊 β酪蛋白 (CSN2 )全基因 13.7kb的序列 (GenBank登录号 :AF4 0 90 96 ) .利用PCR RFLP方法鉴定第 14和 192位氨基酸残基相应的核苷酸序列中出现的 2个多态性位点 ,其中第 192位氨基酸残基处的TspRⅠ位点是Saanen奶山羊CSN2基因中新发现的 1个多态性位点 .生物信息学方法分析山羊CSN2基因可见 ,非编码区中的SINE和LINE序列内含多种乳蛋白基因表达调控元件 ,对其基因的顺式表达和转录后调控可能具有重要的作用     

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素（hEPO）转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因（BLG）调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×10^2IU、1.90×10^4IU、1.91×10^4IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。     

牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区的克隆及其功能检测

通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区序列,在线软件分析表明5＇调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP4等转录因子结合位点。采用DNA重组的方法,将克隆得到的5＇调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载体pEGFP-JFALP。重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间的延长而增强。结果表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础。