人促红细胞生成素受体胞外区基因的克隆及其在大肠肝菌中的表达

以人胎肝为材料,通过ＰＴ－ＰＣＲ的方法扩增出人促红细胞生成素受体（ｈＰｅｏＲ）的胞外区基因。将获得的或熟体胞外区基因起始密码子改构后克隆原核表达载体ｐＢＶ２２０中,进行原核温控诱导表达。表达产物经蛋白Ｎ端测序及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验证实表达产物是ｈＥｐｏＲ胞外区蛋白。利用上罐发酵培养获得的包涵体蛋白经复性纯化后,体外生物学活性检测表明表达产物可特 抑制ＴＦ－１细胞在Ｅｐｏ刺激下的生长,证实了     

获得高质量受精卵进行转基因

在转基因小鼠的建立过程中,获得高质量的受精卵是进行外源基因微注射和受精卵植物的关键一步。本研究中通过对获得的资料做统计学处理,建立了预测受精卵数量和质量的回归方程。对获得的受精卵进行了培养和微注射,为有效建立转基因鼠提供依据。     

胚胎发育早期转基因的PCR检测研究

转基因在受精卵中的整合时间对于转基因动物的建立十分重要。采用ＷＡＰ基因调控序列指导的人Ｇ－ＣＳＦ基因为构件,对小鼠受精卵进行显微注射。对培养至１细胞期、２细胞期和８细胞期的胚胎进行ＰＣＲ检测。结果表明,三个时期转基因的检出率分别为１００％、７７．７７％和４４．４４％。说明随着培养时间的增加,转基因逐渐丢失。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL。这为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据。     

RNA的错误剪接影响转基因的表达

利用PCR扩增方法获得1.5 kb人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因组基因,将其受控于2.6 kb的鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子下,构建成乳腺表达载体.通过显微注射方法建立转基因鼠,PCR及DNA印迹鉴定证实获得两只转基因阳性鼠.在其乳腺表达出极低的G-CSF.为探讨低表达的原因,采用RT-PCR方法,从转基因鼠乳腺获得G-CSF cDNA,序列分析表明,其RNA剪接出现错误,将其第四外显子识别为内含子,由此导致其低水平表达.     

小麦HMW-GSIDx5基因在小麦不同发育阶段表达的研究(英文)

小麦面粉的烘烤品质与其高分子量谷蛋白5亚基（HMW－GSIDx5）基因的表达有关。本文从该基因的组织、器官特异性和特定发育阶段的表达特性等方面,对其在小麦发育过程中表达的变化规律进行了研究,从分子水平为小麦的栽培和育种提供依据。显微切割普通小麦钢82－122的ID染色体长臂为模板,扩增该基因400bp的片段为探针（Fig．1）,并经重组后测序（Fig．2）确认扩增无误。小麦苗期、生长期、开花期及成熟期分别取样、分离总RNA、做斑点（Fig．3,4＆5）或Northern杂交（Fig．6）、并扫描足量（Fig．7）。结果表明：该基因只在籽粒中表达（Fig．3,4＆5）,从开花15天起（Fig．4）,逐渐增加,至腊熟期达最高,以后渐次降低（Fig．6＆7）,有趣的是：在干种子和萌发种子亦有少量表达（Fig．1）。Cressey和陈和等方曾报告在开花15天可检测到HMW－GS蛋白。     

普通小麦-中间偃麦草TAI-27中附加染色体的显微切割及特异性探针的筛选

试验以长穗偃麦草基因组DNA为探针 ,与普通小麦 中间偃麦草TAI 2 7进行染色体原位杂交 ,表明有 4条与长穗偃麦草同源的染色体 ;以P .stipifolia (St)基因组DNA为探针 ,有 4条与St同源的染色体 .这说明TAI 2 7中有 4条St染色体 .TAI 2 7是异代换 附加系 .对TAI 2 7中附加的中间偃麦草染色体进行显微切割 ,并建立其微克隆库 ,从中筛选获得了中间偃麦草的特异性探针 ,同源性分析表明该序列为一新序列 .这为进一步筛选抗病、抗逆和优质基因打下基础 .     

不同孵化时期蛋壳气孔分布特点的研究

本试验对不同孵化时期及蛋壳不同部位气孔特性进行研究。结果表明,蛋气室端壳气孔数目显著高于小端气孔数目(P<0.05),中死蛋壳气孔数目明显低于正常发育蛋(P<0.01),但这些蛋壳厚度却无明显差异。试验表明,壳气孔对胚胎发育有着重要作用。     

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。从而省去