嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要调节功能,转硫途径相关酶促进半胱氨酸的生成和硫化氢产生。本研究从嗜热四膜虫中鉴定一种胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase 1,CGL1,TTHERM_00052400）基因。CGL1在营养生长期高水平表达,而在饥饿阶段和有性生殖期,维持在较低的表达水平。通过密码子优化,人工合成CGL1基因,构建重组表达质粒pGEX-CGL1,转化大肠杆菌BL21(DE3)。E.coli/pGEX-CGL1表达重组蛋白质GST-Cgl1,并通过亲和层析获得纯化。GST-Cgl1裂解胱硫醚产生半胱氨酸,也具有裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H2S的活性。进一步构建重组质粒pNEO4-3HA-CGL1和pSMC1hpNEO-CGL1,转化四膜虫细胞,获得带有HA标签和干扰CGL1的突变体细胞株。免疫荧光定位表明,HA-Cgl1生长期定位在亲本大核,饥饿期定位在细胞质,有性生殖前期定位在亲本大核,而在后期定位在胞质中。CGL1干扰的突变体细胞株在有性生殖过程中不能形成合子核,发育中的小核异常降解,产生仅有大核的异常单细胞。结果表明,嗜热四膜虫含有进化中保守的胱硫醚γ-裂解酶Cgl1。Cgl1具有产生和裂解半胱氨酸的活性。Cgl1定位在细胞质和细胞核中,参与了有性生殖过程细胞核的发育。     

人Notch2受体胞内区基因N2ICD的原核表达、纯化和鉴定

[目的]构建含Notch2胞内区基因N2ICD的原核重组质粒,并在E.coli中表达。[方法]根据Gen Bank上N2ICD基因序列设计引物,用PCR从真核重组质粒p CMV-Tag4/N2ICD中扩增目的基因,克隆至携带GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中并转化E.coli BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌体经反复冻融、溶菌酶破菌、超声破碎后,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达形式,表达产物经谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose 4B纯化并经Western Blot鉴定。[结果]PCR获取了目的基因人N2ICD,并成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1/N2ICD,目的基因在E.coli中成功表达并以部分可溶性形式表达在上清中,纯化后经Western Blot鉴定表达产物分子量在110 k Da。[结论]重组N2ICD在E.coli中成功获得可溶性表达,为研究Notch2受体在细胞信号转导中的作用奠定了基础。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因．以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B．anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌．然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定．最终建立了Cre-LoxP系统在B．anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

人乳头瘤病毒16型E7基因的克隆和表达

用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E7基因。用限制性内切酶DdeⅡ将含有大部分E7基因的191bp片段从HPV16基因组中切出。将此片段与含有色氨酸操纵子的启动子的表达载体pATH10连接成重组DNA,用以转化E.coli DH5α,并筛选出阳性重组子。还进行了限制酶酶切分析和蛋白质SDS-PAGE分析。表达的新蛋白质带的分子量与预期的分子量相符。我们认为表达的新蛋白质是TrpE和E7蛋白的融合蛋白。     

表达NM23-H1/NDPK-A工程菌的遗传稳定性研究

目的:研究重组工程菌的遗传稳定性。方法:利用重组表达质粒pBVNM-H1转化宿主菌E.coli DH5α,筛选重组工程菌DH5α-pBVNM-H1。将新构建好的重组工程菌在无选择压力的条件下进行连续传代培养,比较菌落在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况,并对传代菌株目标蛋白的表达情况以及质粒数量和目的基因DNA进行电泳鉴定。结果:重组工程菌连续传代50次中,在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况相同,目标蛋白表达量无显著差异,质粒数量及目的基因DNA结构稳定。结论:重组工程菌DH5α-pBVNM-H1具有良好的遗传稳定性。     

苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌穿梭质粒的构建和特性研究

将苏云金芽孢杆菌中的pHTA1030质粒与大肠杆菌中的pJH101质粒重组后,构建出pBHGA重组质粒。此质粒通过逐步酶切,缺失后重组得到了14个分子量大小不同的衍生重组质粒。经过对pBHG1重组穿梭质粒在E.coli HB101和B.subttlis 168受体中表达的分析,证明了它带有B.thuringiensis(简写作B.t.)质粒的启动区、启始复制区和对热分离稳定区基因片段,并能高频转化B.t.受体细胞和高表达外源cat基因,同时具有对热分离稳定的特性。为B.t.基因工程体系提供了高效转化表达载体。     

禽流感病毒核蛋白在噬菌体表面的展示

利用PCR技术,扩增禽流感病毒（AIV）核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR—np,以此重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli2（E2）,用溶菌酶缺陷噬菌体T4-zl感染重组E2菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-zl基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-zl—np。经Western blot免疫电镜与ELISA检测证实,T4-zl-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。结果表明,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示,为禽流感防治奠定了基础。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

工程菌种子制备方法对rEPA表达量影响的研究

由重组E.colirPE553D所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA),目前大量以载体蛋白用于多种细菌多糖蛋白结合疫苗研究。rEPA的表达量受众多因素的影响,种子的制备方式就是重要因素之一。本文用长期冷冻保存的和新鲜提取的质粒分别转化宿主菌E.coliBL21(λDE3)后制备种子,并将它们和冻干保存的E.colirPE553D在相同条件下培养和诱导,经SDS-PAGE分析表明长期保存的质粒转化宿主后的重组工程菌生长速度较慢,但rEPA的表达量和新鲜质粒转化制备的工程菌基本相同,而冻干保存的工程菌E.colirPE553D几乎丧失了表达rEPA的能力。     

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR（overlap extension PCR）法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC（44815）质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221（DE3）进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。     

鲈鱼生长激素在甲醇酵母中的胞内表达

甲醇酵母pichia pastoris是一种理想的真核蛋白高水平表达系统.将鲈鱼(Lateolabrax japonicus)生长激素基因克隆到酵母整合型质粒载体pHIL-D2,经转化his4缺陷型酵母GS115,用PCR方法筛选阳性转化子,并用斑点印迹法筛选多拷贝转化子,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的鲈鱼生长激素.     

调宁蛋白T184的定点突变、表达、纯化和鉴定

为增强调宁蛋白对平滑肌收缩的抑制作用,用PCR重叠延长法使调宁蛋白基因中编码第184位苏氨酸的ACT突变为编码丙氨酸的GCC,将此PCR的突变产物装入到质粒载体pAED₄后,转化至E.coli BL₂₁(DE₃)中, 构建的重组转化子用酶切和测序鉴定.诱导含有重组转化子的E.coli获得高效表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定后,采用反复冻融法及葡聚糖凝胶层析柱分离,初步纯化出调宁蛋白突变体T184A.     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水甲和蛋白质水半进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达(英)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

新型瞬时报告载体pRSET-EGFP的构建及表达

目的：利用分子生物学技术和方法将pRSET-B质粒改建为带有绿色荧光蛋白(GFP)突变体基因(GFP-S65T)的新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并在E．coli．BL21中得到GFP基因的高效表达。方法：PCR法从pEGFP质粒克隆GFP-S65T cDNA并在5’末端引入KpnⅠ的位点。将扩增出来的GFP-S65T基因和pRSEY-B质粒用HindⅢ和KpnⅠ双酶切后连接构成重组质粒。用化学法把重组质粒转化到E．coli．BL21中,培养发酵液。OD540=0．4时加入IPTG诱导GFP-S65T基因转录和表达,合成绿色荧光蛋白。还对诱导条件进行了优化,发酵液OD540=0．4加入IPTG可以得到最优表达。结果：通过Ni^2 柱亲和层析,纯化得到绿色荧光蛋白,SDS-PAGE电泳检测,分子量为27kDa,与文献报道值一致。这说明Ni^2 柱能够有效的纯化表达产物。结论：成功构建了新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并且在E．coli．BL21中得到高效表达。     

鸭疫里默氏杆菌RecA作为一种内参蛋白的评价

由于缺少适合的内参蛋白,所以用Western blot的方法来研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达的调节尚未见报道。以鸭疫里默氏杆菌基因组为模板,PCR扩增含有组氨酸标签His-tag的rec A基因和截段的rec AP基因,并分别将其克隆于原核表达载体p ET32a。将重组质粒转化到表达菌Rosetta中,经1mmol/L的IPTG诱导进行蛋白质表达。用组氨酸标签亲和试剂镍-琼脂糖进行重组蛋白质的纯化。用纯化的重组蛋白对4周龄的昆明鼠进行免疫,制备多克隆抗体。Western blot实验表明,截段表达的Rec AP的多克隆抗体血清比全长Rec A蛋白的多克隆抗体血清与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应更特异;在铁离子限制性环境和血红素丰富环境中培养的鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白表达量一致。因此,鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白可以在铁离子和血红素代谢等研究中作为Western blot的内参蛋白。     

肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。