NAG11和NAG12基因转染对鼻咽癌细胞生长的影响

为了考察鼻咽癌表达下调／缺失基因NAG11和NAG12对鼻咽癌细胞系HNE1生长的影响,构建了NAG11和NAG12基因真核表达载体pcDNA3.1（＋）／NAG11和pcDNA3.1（＋）／NAG12,采用脂质体转染技术将真核重组质粒和空载体质粒分别导入HNE1细胞,观察转染后HNE1细胞生物学特性的变化,结果显示,NAG11重表达对HNE1细胞生长和细胞周期没有明显的影响,而NAG12重表达对HNE1细胞有生长抑制作用,与空载体转染组相比,倍增时间由24.1h延长至31.1h,停滞于G0－G1期细胞数由51.42%增加至68.14%。以上实验进一步说明鼻咽癌是多基因改变的疾病,NAG12的重表达有助于处国咽癌恶性表型的逆转。     

BRD7单核苷酸多态性及鼻咽癌易感性分析

为了探讨BRD7基因的遗传变异在鼻咽癌发生的作用,采用PCR-SSCP和直接测序方法对BRD7 基因的编码区进行单核苷酸多态性（coding-region single nucleotide polymorphism, cSNP）分析,并对两个鼻咽癌家系的高危成员、57个散发性鼻咽癌病人和50个正常人进行了BRD7等位基因分型.在BRD7基因的编码区发现了3个cSNP（C450T、A538C和A737G）,其中A538C颠换导致其编码蛋白的第162个氨基酸由Asp变为Ala;C450T改变与同义的A737C多态性偶联发生在87.7%的鼻咽癌活检组织和配对的外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及8个易感成员,但是仅存在于22%的正常人血标本中.C450T多态性变化可以导致其编码蛋白在第133位氨基酸的翻译终止（G133Ter）.以上结果说明,C450T和A737C偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要遗传易感风险因子之一（P＜0.01）;BRD7基因有两种翻译方式,G133Ter可以导致另一种截断的翻译本（truncated isoform）.     

鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆

为了验证通过ＣＤＮＡ代表性差性分析法（ｃＤＮＡ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ）分离的ＣＤＮＡ序列在鼻咽癌活给组织中的差异表达,并进一不克隆鼻咽癌差异表达基因,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法并结合Ｎｏｔｔｈｅｒｎ杂交确定其转录本的大小,进而充分利用生物信息学对有差异表达ＣＤＮＡ全长进行克隆,并对其基因产物进行了结构和功能预测。结果显示,ＡＦ０９１５     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达(英)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

应用酵母双杂交系统筛选BRD7相互作用的蛋白质

BRD7基因是鼻咽癌组织表达下调/缺失的基因, 有强烈的鼻咽癌细胞系HNE1生长抑制作用. 利用酵母双杂交系统筛选与BRD7蛋白相互作用的蛋白, 首先将BRD7基因的完整阅读框架部分亚克隆至pAS2载体(BRD7-BD), 然后以BRD7-BD为靶蛋白, 筛选人胎脑cDNA文库, 在4.8×10⁶个转化子中筛选到11个阳性克隆, 序列测定表明, 分离到溴区包含蛋白3, 溴区包含蛋白2, β-IκB激酶, KIAA1375蛋白, 白介素7和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位等与BRD7相互作用蛋白, 说明BRD7可能与BRD3或BRD2蛋白形成异源二聚体或三聚体发挥核内转录调节功能.     

一个有假基因特点的鼻咽癌相关基因的分离和克隆(英)

用定位候选克隆法克隆了一个与鼻咽癌相关的基因,命名为NAG73基因. 结构分析显示NAG73的基因序列无内含子, 无典型的启动子序列, poly A尾.与人类生长激素促分泌因子基因的第4个外显子和3′端非翻译区同源.说明NAG73可能是人类生长激素促分泌因子基因的假基因. 同时，实验证明NAG73在一些细胞和组织中活跃表达.在正常鼻咽上皮细胞，鼻咽癌上皮细胞和鼻咽癌活检组织，NAG73有表达差异.序列分析显示NAG73有编码翻译产物的可能.NAG73可能可编码产物.该产物在鼻咽癌的发病发展中发挥作用.     

一个新鼻咽癌抑瘤候选基因的克隆及其功能初步分析

从cDNA 代表差异分析法（cDNA representational difference analysis, cDNA RDA）分离的新cDNA片段入手,进一步采用RT-PCR验证,其中发现AF152605片段在74%鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)活检组织中表达下调和缺失,DNA印迹显示其代表一转录本为2.1 kb的基因,结合生物信息学,运用文库筛选克隆该基因,命名为NAG4基因,GenBank登录号AF179285,定位于6q22.1～22.33,至少含有两个外显子,并在第一外显子的上游有TATA盒样序列,编码一个508个氨基酸组成的、分子质量为57.4 ku的蛋白质;功能预测NAG4基因产物与小鼠溴区蛋白BP75有84%同源,是含有多个磷酸化位点和溴区结构域的核内转录因子;突变分析表明NAG4基因在HeLa细胞株中发生整码突变.以上结果说明NAG4基因是鼻咽癌抑瘤基因的良好候选者,其表达的下调参与了鼻咽癌的发生.     

一个有假基因特点的鼻咽癌相关基因的分离和克隆

用定位候选克隆法克隆了一个与鼻咽癌相关的基因,命名为NAG73基因,结构分析显示NAG73的基因序列无内含子,无典型的启动子序列,polyA尾,与人类生长激素促分泌因子基因的第4个外显子和3′端非翻译区同源,说明NAG73可能是人类生长激素促分泌因子基因的假基因,同时,实验证明NAG73在一些细胞和组织中活跃表达,在正常鼻咽上皮细胞,鼻咽癌上皮细胞和鼻咽癌活检组织,NAG73有表达差异,序列分析显示NAG73有编码翻译产物的可能,NAG73可能可编码产物,该产物在鼻咽癌的发病发展中发挥作用。