富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达(英)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的克隆与在脑瘤中的表达分析

在染色体7q31-32多种肿瘤杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）高频区,采用表达序列标签（expressed sequence tag,EST）介导的定位候选克隆策略获得了一个定位于人染色体7q31-32的新基因（GenBank 登录号: AF196976）.该基因编码653个氨基酸,蛋白质理论pI/m:6.58/72.7 ku.它包含七个典型的LRR、一个IgC2样结构域.此外,它还包含一个N端信号肽、一个C端跨膜区.其结构特征表明它是富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）超家族的新成员.经过人类基因组命名委员会的同意,将该基因命名为LRRC4.此外,通过序列相似性匹配还获得了定位于小鼠6号染色体的LRRC4的同源基因（GenBank 登录号: AF290542）.RNA印迹和RT-PCR检测发现LRRC4在正常人脑组织相对特异表达,而在多种原发性脑瘤表达明显下调或缺失.综合考虑LRRC4基因的序列特征及表达谱,提示LRRC4基因可能在神经系统中发挥重要作用.     

LRRC4融合蛋白的构建与表达研究

在前期工作中,采用EST介导的定位候选克隆策略,克隆了一个在脑瘤中表达下调的脑特异表达新基因LRRC4,为进一步研究其结构与功能的关系,构建了含LRRC4基因全长编码区的pGEM-T Easy质粒,在此基础上通过亚克隆构建了LRRC4融合蛋白的绿色荧光蛋白（pEGFP-C1）表达质粒,瞬时转染哺乳动物细胞,结果发现表达的LRRC4融合蛋白定位于活细胞的细胞膜上.同时,构建了LRRC4全长和截短型原核表达pGEX-4T-2质粒,成功而高效地在大肠杆菌BL21 中表达LRRC4融合蛋白.上述工作为制备多抗,深入研究LRRC4基因的功能奠定了基础.     

鼻咽癌相关基因NAG7编码产物的表达和定位分析

为了研究NAG7基因编码产物的特性和在活细胞内定位与表达,首先利用生物信息学分析NAG7编码蛋白的一般性质并预测其定位,再通过构建增强型绿色荧光蛋白（Enhance green fluorescent protein,EGFP)与NAG7融合基因的真核表达载体pEGFP-C2-NAG7,通过脂质体介导分别转染非洲绿猴肾细胞系COS7和人鼻咽癌细胞系HNE1,瞬时表达后荧光显微镜观察NAG7基因编码蛋白的活细胞内定位及表达,研究结果表明NAG7的编码产物可以COS7细胞中高表达并定位于细胞浆,而在HNE1细胞中虽也定位于胸浆,但仅有极少数细胞存在表达,因此NAG7编码产物在HNE1中的表达差异是否是NPC发生的原因之一有待深入研究。     

染色体7q32-ter鼻咽癌相关基因的初步研究

为克隆7q32-ter区域等位基因杂合性丢失最小共同缺失区的鼻咽癌相关基因.以STS D7S509为探针,PCR法筛选位于该区的细菌人工染色体(BAC)克隆,应用EST介导的定位-候选克隆策略并结合生物信息学筛选出在鼻咽癌细胞株和活检组织中表达增强的EST AA773454,cDNA克隆测序和生物信息学资源获取全长cDNA,DNA印迹和甲基化分析研究其表达增强的机制.结果表明,克隆的NAG18基因cDNA全长802 bp,编码227个氨基酸,定位于胞核.该基因分别与人、鼠TAXREB107基因及RPL6基因高度同源.其表达增强的机制不是基因拷贝数的丢失和甲基化位点的改变.可以断定NAG18是定位于7q32-ter最小共同缺失区的鼻咽癌相关基因,它是一高度保守的基因,参与了DNA的转录活化.     

淋洗与植物作用耦合对盐渍化土壤的改良效应

以甘肃秦王川引大灌区盐渍化土壤为背景,以当地5种耐盐植物为材料,采用根袋法盆栽试验动态研究了淋洗结合植物种植对盐渍化土壤改良的效应。结果表明:与种前相比,单纯的淋洗作用对土壤pH值影响不大,而淋洗结合植物种植明显降低了土壤pH值,且根际土壤pH值小于非根际土壤的,5种耐盐植物中霸王根际土壤pH值降低幅度最大,达0.6个单位。K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-和SO2-4在5种植物根际土壤中均有不同程度的富集,富集程度因物种的不同而不同,随培养时间的延长而呈波动状态。5种供试植物和对照组土壤中的6种主要的可溶性盐分离子随淋洗次数和培养时间的延长呈下降趋势。在培养120d后,单纯淋洗的土壤中K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-和SO2-4的含量相比种前平均分别降低了33.3%、26.1%、35.6%、32.5%、35.5%和36.3%,植物吸收带走的上述各离子的含量平均分别占种前的46.2%、8.1%、30.2%、7.2%和21.6%,其中霸王吸收带走的盐分离子最多,而淋洗结合种植植物的土壤中上述各离子的含量与种前相比平均分别降低了67.25%、63.73%、83.8%、67.5%、81.55%和78.46%,由此可见,淋洗结合植物种植的脱盐效果优于单纯淋洗,且土壤中主要的盐分离子Na+、Cl-和SO2-4的含量降低幅度最大,通过计算得出,在Cl-、SO2-4和Na+减少的总量中还有37.73%的Na+、38.22%的Cl-和35.14%的SO2-4的减少量是由植物根系的物理化学作用机制引起的。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

镜检脑脊液白细胞定量计数方法改进的研究

目的:建立手工法镜检脑脊液白细胞定量的快速、准确、直观的检测方法,并验证该方法比传统方法准确并可靠性高。方法:无菌条件下采集患者脑脊液标本230例,分别采用中华人民共和国卫生部医政司出版的《全国临床检验操作规程》上的规程法、定量法。两种方法对于同一样本进行白细胞数计数,实验重复3次,用单因素方差分析进行统计学比较。结果:镜检脑脊液白细胞计数定量的方法比传统的方法(P>0.05,sd,cv值更小)更准确精密可靠。结论:计数定量的方法比规程法更准确,精密,可靠。     

表达序列标签数据库搜索鉴定小鼠UBAP1基因及其数字化表达分析

UBAP1(ubiquitin associated protein 1)基因是最近克隆的一个定位于人类染色体9p21-22鼻咽癌杂合性丢失高频区的泛肽相关蛋白家族新成员.为了深入研究UBAP1基因的功能,利用计算机对表达序列标签(expressed sequence tag, EST)、UniGene等数据库进行综合搜索分析,结合cDNA克隆测序的方法, 成功地获得了UBAP1基因在小鼠中的同源基因.小鼠UBAP1基因cDNA全长为2 676 bp,编码一个由441个氨基酸组成的蛋白质,在其蛋白质C端只有一个泛肽相关功能域（UBA domain）.与人UBAP1基因相比,两者编码的氨基酸序列有89%相同.基于EST的数字化表达分析显示UBAP1基因在小鼠正常组织中广泛高表达.