USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达

为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达, 将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA 聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上, 然后在T7 RNAP 前后各加入500 bp用于同源重组的片段, 再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B. cepacia基因组上, 使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上, 构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCMΔlipAlipB、pUCPCMΔlipA、pUCPCMΔlipB七种表达质粒, 通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B. cepacia宿主菌中, 最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高, 达到607 U/mg, 与野生菌相比酶活力提高2.8倍, 并且除含pUCPCMΔlipB的工程菌外, 其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀, Sephadex G-75凝胶过滤纯化后, 比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg。以上结果表明, 构建的基于T7表达系统的B. cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量, 同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。     

构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达eGFP基因

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(eGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对eGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的eGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达eGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中eGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。     

糖基化磷脂酰肌醇锚定型EGFP真核表达质粒的构建及表达

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达.分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243 bp GPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pEGFP-C1质粒中,构建并鉴定pEGFP-C1-GPI质粒.经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况.经酶切和测序鉴定证实,所克隆的CD24 GPI序列正确,荧光显微镜观察pEGFP-C1-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pEGFP-C1质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光.成功构建与EGFP相连的GPI真核表达质粒,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚定表达型肿瘤疫苗奠定基础.     

BALB/c小鼠I-Ad αβ链RFP融合双顺反子表达载体的构建及其在COS-7中的表达

构建了在β链C端融合红色荧光蛋白(RFP)标签的BALB/c小鼠I-Adαβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-Ad,使用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞,用激光共聚焦显微镜观察外源蛋白在细胞中的表达与定位.I-Adαβ分子在COS-7细胞中能够以较高的效率表达,并且在COS细胞中能形成聚集状态.与通常的真核翻译帽子结构起始相比,IRES启动真核翻译系统的效率低于前者;与空质粒对比,IRES介导的真核翻译起始,RFP的表达量较低.     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.     

pEGFP—HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达。由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对：HPV16E7分子生物学特性．致瘤机理及APC提呈等的研究。为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础。     

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。     

基于FMDV IRES的双顺反子载体的构建及体外表达分析

利用RT-PCR扩增出口蹄疫病毒小核糖体进入位点（IRES）序列,并定向克隆进pcDNA3.1(+)载体,构建成双顺反子真核表达载体。为了验证该载体是否能够转录出双顺反子mRNA,在IRES起始密码（ATG）下游正确插入增强型的绿色荧光蛋白基因（egfp）,把重组质粒转染BHK-21细胞,培养20～48 h,在紫外显微镜下观察,能够看到典型的绿色荧光,表明载体能够体能够利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因。并通过流式细胞仪,与同样是CMV启动转录egfp的pGFPN1质粒在细胞中的表达的水平进行了比较。该载体的成功构建为体外表达双基因、双顺反子逆转录载体构建以及相关应用奠定基础,并有作为基因疫苗和标记定位基因治疗载体的潜力。     

核酸疫苗双表达载体的构建及表达

将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXI载体多克隆位点,构建出核酸疫苗双表达载体pVI。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和新霉素磷酸转移酶(neor)基因作为报告基因,连接到pVI载体IRES基因的前后两处多克隆位点,构建出表达载体pEIN。通过脂质体介导的方法将该载体转染COS-7细胞,筛选到同时表达绿色荧光蛋白和新霉素磷酸转移酶的表达株,表明成功地构建了核酸疫苗双表达载体,为构建多价核酸疫苗及带有分子佐剂的核酸疫苗打下了基础。     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒O/QYYS/s/06株感染性克隆的构建

本研究在完成FMDVO/QYYS/s/06株全基因组序列测定的基础上,分3段对全基因组进行克隆,其后将各片段克隆到载体P43中,从而获得携带O/QYYS/s/06株基因组全长cDNA的重组质粒P43C。将重组质粒P43C与表达RNA聚合酶的质粒T7共转染BHK-21细胞,48h后收获培养液接种2~3d乳鼠,取经乳鼠传代后的第4代病毒液,经反向间接血凝、中和试验和测序等方法证明拯救的病毒为O型FMDV。以上结果表明,O/QYYS/s/06株全长cDNA分子克隆的构建成功。     

含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建

利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-CP。将FMDV的内部核糖体结合位点（IRES）保守序列连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pCPES。将重组质粒pCPES转化宿主菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达。蔗糖密度梯度离心纯化表达产物。透射电镜观察到直径大约26 nm的圆形病毒样颗粒。检测病毒样颗粒的稳定性并进行RT-PCR鉴定。结果表明该病毒样颗粒含口蹄疫病毒IRES RNA序列,并且稳定性良好,本研究构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。     

一种原位示踪外源目的基因表达载体的构建

应用分子克隆技术 ,分别将增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)、内部核糖体进入位点 (internalribosomeentrysite,IRES)和编码H-ras基因C端 2 0个氨基酸的DNA(rasc2 0 )片段插入真核表达载体pcDNA3,构建真核重组表达载体并将其命名为pZX。通过脂质体介导将该载体转染人宫颈癌细胞系HeLa ,培养过夜后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,并与pEGFP-C3质粒DNA转染该细胞系进行比较。结果表明 ,转染pZX载体的实验组细胞膜发出绿色荧光 ,而对照组绿色荧光则均匀弥散于整个细胞中 ,工具性载体pZX已构建成功     

新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证

目的: 构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法: 设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMV promoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassette Ⅱ),在其上下游添加Nru Ⅰ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用Nru Ⅰ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,Nru Ⅰ及Bgl Ⅱ/Pst Ⅰ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果: 两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论: 成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.     

异种化人肾细胞癌特异性抗原G250真核表达载体的构建及表达

目的：构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250（CAⅨ）主要T细胞表位区域、猴和鼠CAⅨ部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法：通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-Fc-GPI中,继而又将酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7转染COS7细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达。结果：测序结果表明tG250融合基因序列正确,PCR和酶切鉴定证明已将其连入真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7在COS7细胞中得到很好的表达。结论：构建了重组质粒pVAX1-sig-t G250-Fc-GPI-GM/B7,且在COS7细胞中有效表达,为以G250为靶点的抗肾细胞癌基因疫苗的构建与功能研究奠定了基础。