重组虎源H5N1流感病毒HA基因犬2型腺病毒的构建与实验免疫研究

H5N1流感病毒可以对虎和猫产生致死性感染,为研制可用于预防猫科动物流感的新型疫苗,构建了重组虎源H5N1流感病毒HA基因的犬2型腺病毒。将A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有HA基因的表达盒(CMV HA PolyA)克隆入pVAXΔE3的SSPⅠ酶切缺失处,获得含有HA表达盒的穿梭载体pΔEHA。用SalⅠ NruⅠ分别对pΔEHA和pPoly-2-CAV2进行双酶切,将含有HA表达盒的SalⅠ NruⅠ片段克隆入pPoly2-CAV2,获得了在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。释放CAV-2/HA重组基因组转染MDCK细胞,获得了重组活病毒CAV2/HA,经Western blot分析表明重组表达产物可被流感病毒HA单克隆抗体3A13所识别。使用该重组病毒免疫猫可以产生效价为1∶8~1∶16的抗H5亚型流感病毒血凝抑制抗体。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的, 利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin 基因, 得到的β-actin 基因片段SZ21包含启动调控区, 大小为2 398 bp。SZ21的启动调控区包括β-actin 基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA 框和CArG 框等元件。对启动子序列在线分析表明, 获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子, 将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上, 构建成重组表达载体β2 pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明, 克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实, 克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性, 在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA, 均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体。首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培 养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV- VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX △E3VP2。用Sal I Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2 全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2。Cla I Asc I酶切pCAV-2-FPV- VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2。该重组病毒能使MDCK细胞产生 腺病毒样细胞病变。Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白。该重组病毒可以有 效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体。本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株。     

猪霍乱沙门氏菌递送的双启动子表达载体的构建

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗,还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力,本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础,将其真核启动子CMVie与原核启动子Ptrc串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500,得到工程菌C500/pEGFPPtrcR,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达,该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光,被证明在体外至少能稳定遗传20代;采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞,EGFP在胞核和胞浆内表达,24h后观察可到明显绿色荧光。结果表明,双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功,预示其携带的外源基因既可在C500中表达,又可在体细胞中表达,为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

survivin启动子驱动的shRNA在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达

研究survivin启动子驱动的小发夹RNA(shRNA)在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达.PCR扩增survivin启动子,构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv,并检测survivin启动子的活性;构建针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并检测shRNA在U6启动子驱动下的干扰效果;用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6载体中的U6启动子,从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv;将pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv转染到宫颈癌SiHa细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化.结果表明,成功扩增survivin启动子并验证该启动子具有活性;成功构建EGFP shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并验证shRNA在U6启动子驱动下具有较好的干扰效果;成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv载体,分别转染SiHa及HuVEC细胞,在SiHa 细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达.survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌SiHa细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达.     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

GFAP启动子调控的双顺反子真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27的构建及表达分析

目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质细胞特异性真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染体外培养的星形胶质细胞,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功构建真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染星形胶质细胞后可见EGFP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中P27表达水平明显增高。结论GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子GFAP的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究星形胶质细胞增生与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。     

共表达siRNA和hIL-12的新型乙肝多表位DNA疫苗的研究

目的 构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法 设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspH I位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的Mlu I位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hIL12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。结果 经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV 多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 pg/mL细胞上清,72 h检出量为1 712 pg/mL细胞上清;转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。结论 成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果。我们的工作为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

To construct the eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 gene and observe its expression in vitro, the recombinant expression vector pVAX1GP120 was constructed by inserting the gp120 gene into the eukaryotic expression vector pVAX1. The pVAX1GP120 was transfected into Vero cells by lipofectamine and the expressed product was detected by indirect immunofluore- scence.Restriction enzymes digestion analysis and sequencing results revealed that the recombinant expression vector pVAX1GP120 has been constructed successfully. The indirect immunofluorescence result showed green fluorescence on the membrane of transfected cells. The constructed eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 can be expressed in vitro, which lay the foundation for the further study of HIV-1 DNA vaccine.     

三重表达肺结核DNA疫苗在细胞水平的检测

目的 检测共表达siRNA、抗原基因与hIL-12的新型肺结核DNA疫苗在人胚肾293细胞中表达。方法 在已构建含有靶向抗调亡基因Mcl-1L的siRNA、结核分枝杆菌抗原基因Ag85B-ESAT6 (PVAE)、hIL-12的新型肺结核DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12基础之上,将抗原基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合,得到真核表达重组质粒pVAX1-siRNA-PVAE-EGFP-hIL12。并将siRNA单元用靶向EGFP基因的siEGFP代替,得到pVAX1-siEGFP-PVAE-EGFP-hIL12重组表达载体。用重组质粒转染人胚肾细胞293,分别观察融合抗原基因与siEGFP的表达。以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果 经酶切鉴定和测序证实肺结核DNA疫苗改造成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达。对照组检测到siEGFP的表达。转染48 h后检测出细胞上清中hIL-12的量为1571.63 pg/mL;72 h后检测出细胞上清中hIL-12的量为2392.25pg/mL。结论 已构建的肺结核质粒DNA疫苗能在真核细胞中有效表达siRNA、抗原基因与hIL-12。为进一步研究该DNA疫苗抗肺结核的免疫治疗和基因治疗效果打下基础。     

核酸疫苗双表达载体的构建及表达

将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXI载体多克隆位点,构建出核酸疫苗双表达载体pVI。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和新霉素磷酸转移酶(neor)基因作为报告基因,连接到pVI载体IRES基因的前后两处多克隆位点,构建出表达载体pEIN。通过脂质体介导的方法将该载体转染COS-7细胞,筛选到同时表达绿色荧光蛋白和新霉素磷酸转移酶的表达株,表明成功地构建了核酸疫苗双表达载体,为构建多价核酸疫苗及带有分子佐剂的核酸疫苗打下了基础。     

异种化人肾细胞癌特异性抗原G250真核表达载体的构建及表达

目的：构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250（CAⅨ）主要T细胞表位区域、猴和鼠CAⅨ部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法：通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-Fc-GPI中,继而又将酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7转染COS7细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达。结果：测序结果表明tG250融合基因序列正确,PCR和酶切鉴定证明已将其连入真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7在COS7细胞中得到很好的表达。结论：构建了重组质粒pVAX1-sig-t G250-Fc-GPI-GM/B7,且在COS7细胞中有效表达,为以G250为靶点的抗肾细胞癌基因疫苗的构建与功能研究奠定了基础。     

Evaluation of mammalian codon usage of fimH in DNA vaccine design

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) bacteria are the principal cause of urinary tract infections (UTI). Because these bacteria propagate intracellularly, the cellular immune response is an important factor in UTIs. Therefore, we designed a genetic construct to induce a cellular immune response. In order to develop a genetic construct that induces strong cellular immunity against this pathogen, we used the fimH synthetic gene according to mammalian codon usage, and the gene expression was compared with wild type codon usage. Initially, we designed two constructs, pVAX/fimH mam and pVAX/fimH wt, which contain mammalian and wild type codon usage, respectively. The Cos-7 cell line was transfected separately with a complex of pVAX/fimH mam-ExGene 500 poly cationic polymer and pVAX/fimH wt-ExGene 500 poly cationic polymer. Expression of the fimH gene in both constructs in COS7 cells was confirmed by RT-PCR, SDS-PAGE, and Western blotting. Both of the pVAX/fimH cassettes expressed inserted fimH genes (mam and wt) in Cos-7 cells. Our results suggest that codon optimization successfully expressed the fimH gene because the fimH gene with mammalian codon usage is compatible with the eukaryotic expression system. Therefore, mammalian codon usage could be appropriate in a pVAX/fimH construct as a DNA vaccine.     

新型真核表达质粒pcDNA6/myc-his-EGFP B 的构建及其在重组基因表达中的应用

增强型绿色荧光蛋白（EGFP, enhanced green fluorescent protein）、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记,EGFP能发出的绿色荧光,myc抗原能用相应的抗体检测,6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止,没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体,我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是,为确保目的基因与EGFP基因融合表达后,融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性,我们运用LINKER程序在EGFP基因的5'端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2（IL-2, human interleukin 2）信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中,使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达,构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞,48 h后成功观察到绿色荧光;用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠,8 h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构,结果表明：IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰,连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。     

新型二合一PiggyBac转座系统的构建及功能验证*

目的:PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元件,采用“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行转座;通过将转座子元件和转座酶表达框整合到一个表达载体中,构建简便易用的二合一PB转座系统。方法:通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)获取PiggyBac转座系统所需转座子元件和转座酶表达框,利用T4 DNA连接酶将转座酶表达框插入到pUC18载体上,再利用Gibson同源重组技术将转座子元件与重组载体结合构建二合一PB转座系统;使用该系统携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以及功能性损伤抑制蛋白(damage-suppressing protein,DSUP)检测其有效性及可靠性。结果:在所有筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,EGFP都是明亮可见;利用此二合一PB转座系统成功获得了可高效表达功能性损伤抑制蛋白的稳定细胞系,证明外源基因可被有效整合到基因组DNA中并表达。结论:成功构建了新型二合一PB转座系统,使稳定表达细胞系的建立更加经济简便。     

Expression of rabies virus glycoprotein gene into eukaryotic system and determination of potential T-cell epitopes

The present study was undertaken to clone, express rabies virus glycoprotein (RVG) and to identify potential T-cell epitopes on it. RVG gene (1590 bp) was amplified using gene specific primers. The amplified product was cloned into pTZ57R/T cloning vector by TA cloning. RVG gene was subcloned into pcDNA3.1 (+) expression vector. In this study, cloning and expression of rabies virus glycoprotein gene was done under CMV promoter and an expression construct (pcDNA.RVG) was prepared and clones were confirmed by restriction digestion, colony PCR and nucleotide sequencing. The expression construct was further characterized by western blotting and indirect fluorescent antibody test (IFAT). In silico analysis of this protein was done to find out potential antigenic sites so that it can be further evaluated for its potential as candidate for epitope vaccine against rabies.