表达基因鉴定的一种新策略：筛选poly（dA／dT）—cDNAs

低丰度表达基因及组织细胞等特异基因的鉴定是人类表达基因鉴定的瓶颈,Wang等认为cDNA中的长序列poly(dA/dT)是限制低丰度表达基因等鉴定效率的主要原因,为此提出了一种新策略,即用3′端锚定oligo(dT)11代替常规oligo(dT)引物逆转录合成cDNA,并将3′端携带11个（dA/dT)s序列的cDNA称之为poly(dA/dT)^-cDNA,筛选poly(dA/dT)^-cDNAs差减文库可以提高这些基因的鉴定效率。     

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly(A)现象,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,纯化并逆转录mRNA,并应用RD-PCR双方法获得了170多条大肠杆菌poly(A)化mRNA的基因片段,利用这些片段打印成基因芯片,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。     

一种制备poly(Ⅰ)·poly(C)-滤纸的新方法

poly(1)·poly(C)-滤纸是一种亲和材料,可以用来吸附与双链核酸有亲和力的酶或蛋白。本文介绍用对-β硫酸酯乙砜基苯胺为活化剂制备poly(I)·poly(C)-滤纸的方法。poly(I)·poly(C)的结合容量为10—35μg/cm~2,用来吸附兔网织红细胞裂解液中2’-5’A合成酶效果良好。在一定范围内,酶活与被吸附裂解液量呈线性关系,说明可以用来定量检测未知样品中与poly(I)·poly(C)有亲和力的酶。poly(I)·poly(C)-滤纸在-20℃保存四个月亲和能力不变。本方法与文献报道的方法相比,操作简便试剂易得。     

应用限制性显示PCR技术构建细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库

针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,以oligo(dT)一纤维素纯化mRNA,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,用限制性内切酶消化cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物组合进行选择性PCR,使各片段得以扩增并分布于10个亚组中,并进行克隆,成功地克隆了100多个基因片段,已对其中40个进行了测序分析,探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA cDNA库构建中的应用价值。     

不同长度poly(C)对口蹄疫病毒基因工程毒的毒力影响

【目的】研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV) poly(C)区段的序列长度与FMDV毒力之间的关系。【方法】首先利用NheⅠ/NotⅠ线化FMDV pGEM-XJ/AKT/69全长重组质粒,制备体外转录本,借助Lipofectamine 2000转染BHK-21细胞,获得基因工程毒。随后,在细胞传代过程中,收取不同代数病毒培养液,提取总RNA进行poly(C)的长度测定,并进行乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50的测定。【结果】我们发现,基因工程毒在BHK-21上连续传代至第6代时,可见明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);在经过一代乳鼠接种之后再重新适应到BHK-21细胞的过程中,poly(C)区段出现了缩短现象;乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50测定结果表明,尽管基因工程毒与母本毒相比毒力偏低,但含有不同长度poly(C)的基因工程毒之间并无显著差异。【结论】poly(C)区段的序列长度在12~17个C之间改变对FMDV基因工程毒的毒力无明显的影响。     

用钙沉淀法分离植物poly(A)-mRNA

本文对Lendes等人用钙沉淀poly(A)—mRNA的方法作了改进。在不加poly(A)的情况下,适当增加总RNA浓度,用15mM CaCl_2沉淀poly(A)—mRNA。使用改进的方法能够得到大量的poly(A)—mRNA。用改进法制各的poly(A)—mRNA;可以用poly(U)—Sepharose4β或oligo (dT)—Cellulose亲和层析作进一步的纯化,也可以直接作为反转录或翻译的模板.     

鼻咽癌转移淋巴结中EB病毒相关的DNA多聚酶的分离及其特性研究

一种新的DNA多聚酶已从鼻咽癌(NPC)转移淋巴结胞核酶液,通过DEAE-纤维素柱层析而被部分纯化,并可与细胞的α-及β-DNA多聚酶分开。 此酶有下列特点可与细胞DNA多聚酶区分:(1)可放DEAE-纤维素吸附,需用130mMK_2HPO_4缓冲液方可洗脱下来。(2)可被浓盐所激活,150——200mMKCl或75mM(NH_4)_2SO_4可使它显示最高的酶活性。(3)最适pH为8.0。(4)对磷酰甲酸盐的抑制较敏感。(5)能很好地利用某些合成模板,如poly(dA)·oligo(dT)_(10)及poly(dA)·oligo(dT)_(12-18)。但不能利用poly(rA)·oligo(dT)_(10),证明此酶并非细胞的γ-DNA多聚酶,而与巴基特淋巴瘤的EB病毒相关的(EBV)DNA多聚酶性质十分相似。对照的Raji细胞未见此种EBV-DNA多聚酶。 从鼻咽癌淋巴结中分离出此种EBV-DNA多聚酶,将对EB病毒与NPC的发病关系提供新的证据。     

人胎肝中肝细胞生长因子poly(A)~ mRNA在非洲爪蟾卵母细胞内的翻译

采用SDS/氯仿/苯酚法和oligo(dT)纤维素亲和层析从人胎肝提取poly(A)~ mRNA,注入非洲爪蟾卵母细胞,翻译出肝细胞生长因子(HGF),产物能从卵母细胞中分泌。在9种细胞(包括人与小鼠的4种不同组织和5种细胞系)检测系统中,证明翻译的HGF与直接提取的HGF活性一致,应用滤膜超滤法估计分子量均在10～30kDa,可以初步认为两者是同一物质。从而,支持了人胎肝HGF是胎儿肝脏细胞基因表达的产物。     

哺乳动物卵子与早期胚胎中全转录组poly(A)尾研究进展

在哺乳动物卵子向胚胎转变过程中，卵子和胚胎中的转录在合子基因组激活之前都是沉默的，因此m RNA转录后修饰在此过程发挥着重要的作用。poly(A)尾巴是影响mRNA命运和翻译效率的一种重要的转录后修饰。随着测序技术和分析工具的进步，尤其是三代测序技术的发展，poly(A)尾的长度和组成能够被精确测量，极大地拓展了人们对于poly(A)尾在哺乳动物早期胚胎发育过程中的认识。本文对poly(A)尾研究方法的发展及其在卵子向胚胎转变中的研究进展进行评述，以期为哺乳动物早期胚胎发育和不孕不育相关疾病的研究带来新的思路。     

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备*

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly (A)现象 ,利用oligo (dT)与poly(A)特异结合的特性 ,纯化并逆转录mRNA ,并应用RD PCR方法获得了 1 70多条大肠杆菌poly (A)化mRNA的基因片段 ,利用这些片段打印成基因芯片 ,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。     

大麦条纹花叶病毒(新疆株)中多聚腺苷酰核糖核酸含量、侵染活性及多聚腺苷酸链长分布的测定

1.用Oligo(dT)纤维素亲和层析将新疆大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ)RNA分为poly(A)~+(与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA和poly(A)~-(不与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA,其相对含量poly(A)~+RNA占75%,poly(A)~-RNA为25%。2.用~(32)P标记法测定了BSMV(XJ)RNA中3′端poly A的链长分布,结果poly(A)~+RNA带有数个至三十几个腺苷酸残基,而poly(A)~-RNA也含十个以下的腺苷酸残基。3.用系统感病寄主大麦进行侵染性试验表明,poly(A)~+RNA与poly(A)~-RNA对大麦具有同等水平的侵染性。4.文中讨论了Oligo(dT)纤维素的分离效果以及所用测定poly(A)链长分布方法的可靠性。     

以CB—F83—Oligo（dT）—纤维素批量亲和层析分离poly（A）RNA

Poly(A)RNA分离是反向转录cDNA,构建cDNA文库以及进行差异杂交等的基础工作,也是改善RNA凝胶吸Ep和S_1核酸酶保护实验质量的基本措施。Poly(A)RNA的分离主要采用Oligo(dT)-纤维素柱亲和层析的方法。我们在非洲爪赡卵母细胞及早期胚胎Poly(A)RNA的分离过程中,先后使用了Poly(A)Quick Column(Stratagene产品)和 Oligo(dT)Cellulose,Type 7(pharmacia产品)柱亲和层析以及CB-F 83-Oligo(dT)-纤     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白(Cap)抑制宿主细胞天然免疫应答

【背景】猪圆环病毒是引起猪圆环病毒病的病原,能够引起严重的免疫抑制和临床症状,给养猪业造成严重的经济损失。【目的】研究猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3,PCV3)衣壳蛋白(Capsid protein,Cap)对宿主天然免疫应答的调控作用,解析其免疫抑制机制对阐明猪圆环病毒致病机制具有重要意义。【方法】通过构建Cap真核表达质粒,利用Westernblotting进行表达验证,实时荧光定量(RT-PCR)、双荧光素酶基因报告系统和ELISA探究Cap对I型干扰素通路活化的影响,通过免疫共沉淀探索其作用机制。【结果】真核表达质粒成功表达并且证实Cap可以抑制DNA模拟物Poly(dA:dT)诱导的I型干扰素通路的活化;Cap可以与天然免疫通路节点分子MITA相互作用。【结论】研究发现PCV3病毒Cap蛋白与干扰素通路节点分子MITA相互作用发挥免疫抑制作用,这为阐明PCV3免疫抑制机制提供了理论依据。     

脓毒血症早晚期肝细胞核被膜NTPase活性及poly(A)+mRNA核浆转运的变化

目的和方法 :在盲肠结扎穿孔脓毒血症大鼠模型上 ,研究早晚期脓毒血症肝细胞核被膜核苷三磷酸酶 (NT Pase)活性及 poly(A) mRNA核浆转运的变化。结果 :脓毒血症早期NTPase活性增加而晚期活性降低 ,即早期Vmax与对照组比增加 6 2 % (ATP ,P <0 .0 5 )和 18% (GTP ,P <0 .0 5 ) ;晚期Vmax下降 2 6 % (ATP ,P <0 .0 5 )和5 6 % (GTP ,P <0 .0 5 )。脓毒血症仅晚期NTPase底物亲和力降低 ,即晚期Km与对照组比分别升高 2 6 % (ATP ,P<0 .0 5 )和 37% (GTP ,P <0 .0 5 )。脓毒血症早期 poly(A) mRNA核浆转运速率增加而晚期降低 ,即早期组 10min转运速率较对照组增加 2 7% (ATP ,P <0 .0 5 )和 30 % (GTP ,P <0 .0 5 ) ;晚期组降低 2 1% (P <0 .0 1)和 35 % (P <0 .0 1)。结论 :脓毒血症肝细胞核膜NTPase活性呈早期升高、晚期下降的双相变化与肝细胞核被膜 poly(A) mR NA核浆转运速率的早、晚期变化相平行 ,同时与脓毒血症血糖浓度的早、晚期变化相关。本实验在一定程度上解释了脓毒血症早晚期代谢双相变化发生的分子机理     

DNA芯片技术中利用内标对数据归一化后检测基因的表达变化

在DNA芯片技术中 ,通过反转录反应 ,由mRNA合成带有荧光标记物的cDNA的过程中 ,往往要参入已知质量的poly(A) + RNA ,以对DNA芯片的检测灵敏度进行归一化处理 .通过体外转录的方法 ,以真核生物的cDNA克隆中的DNA片段为模板合成poly(A) +RNA ,对之定量后 ,以不同的质量比参入到样品的反转录体系中 ,代表不同的RNA拷贝丰度 ,从而对DNA芯片检测的灵敏度进行了定量 ,并得到DNA芯片上杂交点的荧光信号强度与基因表达的RNA拷贝数成正相关的关系 .利用含有内标的DNA芯片检测了热击反应后酵母细胞的基因表达变化 ,结果与Northern印迹方法检测结果是相符的     

poly C和poly Ⅰ酶促合成条件的研究

本文报道了影响酶促合成poly C 的主要因素,找出了合成poly C 的适宜反应条件。聚合率达72.4%,poly C 的沉降常数为8.8S。采用正交设计法研究了影响酶促合成poly I 的九个因素在四个位级上的相互关系,并求出了合成poly I 的最适反应条件。聚合率为72.0%。同时还研究了控制poly I 分子大小的途径;当反应系统相对粘度显最大值后中止反应,此时poly I 的沉降常数为11S。上述反应的特点是利用大肠杆菌的PNPase 粗酶液,而且用酶量少,产率高。在合成poly I时运用了Ca~( )和Mn~( )离子的特殊作用,达到了用粗酶液合成大分子产物的目的。实践证明,这些方法为生产药用poly I:C 提供了可行的工艺路线。     

3′-poly(A)~-病毒RNA的大分子cDNA的合成和克隆

为了合成3′端无poly(A)的病毒RNA(登革热病毒Ⅱ)的3′区的长的cDNA,我们用RNA连接酶,把3′端被pCp封闭了的poly(A)<50bp连在病毒RNA的3′端,构成一个病毒RNA-poly(A)-pCp型模板,可用oligo(dT_(10-12))作引物,再用Watson和Jackson(1985)的RNase H代替硷降解法来合成cDNA。结果获得了≥5kb的cDNA。重组克隆的鉴定证明这个大分子cDNA确是病毒RNA 3′区的拷贝。这将有利于对这类RNA病毒基因组的结构-功能分析和对病毒cDNA拷贝的感染性的研究。     

滋养细胞胞内双链DNA感受器通过MAPK/IκB信号介导炎性细胞因子分泌

目的:探究滋养细胞能否感受胞内双链DNA刺激及其对炎性因子分泌的影响,揭示胎盘的免疫识别和免疫屏障功能,探讨妊娠期感染所致不良妊娠结局的发病机制。方法:利用人工合成的双链DNA模拟物poly (dA:dT)转染人滋养细胞系HTR-8/SVneo,Real-Time PCR方法检测滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达水平;Western Blot检测滋养细胞MAPK和IκB信号的活化情况;ELISA检测HTR-8/SVneo细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的分泌水平。结果:Real-Time PCR结果表明,HTR-8/SVneo能够感受胞内双链DNA刺激并上调包括IFI16、AIM2、DHX36、DHX9、LRRFIP1、KU70、ZBP1/DAI和DDX41在内的多种双链DNA感受器的m RNA表达水平;Western Blot实验结果表明,滋养细胞识别双链DNA后能够促进MAPK和IκB信号通路活化,转染90分钟后ERK、JNK、p38和IκBα的磷酸化水平最高,其后随着时间逐渐减弱;加入IκB、p38和JNK特异性抑制剂能够抑制poly(dA:dT)介导的IL-8、IL-6和CXCL10分泌,但其分泌不受ERK抑制剂的影响;MCP-1的分泌能够被p38和JNK抑制剂阻断,但p38和ERK抑制剂不影响其分泌。结论:人滋养细胞存在功能性胞内双链DNA识别机制,活化的DNA识别信号能够激活MAPK和IκB信号通路,并通过IκB、p38或JNK信号介导IL-8、IL-6、MCP-1及CXCL10等细胞因子和趋化因子的分泌。     

胃粘膜正常和癌变细胞基因组DNA的表面增强拉曼光谱研究

通过测试胃粘膜正常上皮细胞、高、中、低和未分化胃癌细胞基因组DNA的表面增强拉曼光谱,分析各自特征性谱峰。结果表明：正常和高分化细胞基因组DNA在1060cm^-1。被抑制,只在1010cm^-1。被激活,但后者的谱峰更强且出现“红移”,其DNA链结构出现不稳定;中、低、未分化细胞基因组DNA中以上两种振动模式都被激活,说明它们的DNA链出现了断裂,且呈现渐强的趋势。同时也说明了脱氧核糖基在恶性程度越高的细胞基因组DNA中带正电趋势越强。1100—1670cm^-1谱带属于dC,dG,dA,dT的综合振动叠加,恶性程度越高的癌细胞中更多的模式被激活。可见,分化越低的胃癌细胞基因组DNA具有更多的振动模式被激活,与正常的差异更明显,并且DNA链整体带正电的趋势也可能越强,提示可能有更多的氧化反应发生。     

枯草杆菌A_(17)中含Poly(A)的RNA的分离和体外翻译

在以甘油(0.24％)或谷氨酸(0.5％)作为碳源,低磷(6.4×10~(-5)M)合成培养基,37℃下生长15小时的枯草杆菌A_(17),细胞中的含有poly(A)的RNA,可被oligo(dT)-纤维素分离。在培养基中加入赤霉酸(GA_3)30 μg/ml的情况下,含poly(A)的 RNA(峰Ⅱ)约为上柱总RNA的0.16～1.27％,不加GA_3的则为0.16～0.45％。这种含poly(A)的RNA能在麦胚非细胞合成系统中刺激~3H-亮氨酸掺入蛋白质,可为对照的4～8倍,其放射比活性为7000～23000 cpm/μg RNA,说明这种含 poly(A)的 RNA具有mRNA活性。