小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的：表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法：生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。 结果：在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5-C-3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。 结论：实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。     

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第 6外显子可能是一个与TFAR19促凋亡活性密切相关的功能结构域     

日本七鳃鳗Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型与RGD全缺失突变体Lj-112的抗血管新生作用

七鳃鳗Arg-Gly-Asp (RGD) 毒素肽Lj-RGD3与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性,而RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同。为研究Lj-RGD3结构与功能的关系,对野生型Lj-RGD3及其RGD全缺失突变体Lj-112进行了抗血管新生功能研究。将3个RGD模体的全缺失突变体基因Lj-112全序列合成后构建于pET-23b载体,对野生型Lj-RGD3及突变体 Lj-112蛋白进行IPTG诱导表达,重组蛋白经组氨酸亲和层析纯化;采用MTT法测定野生型和突变体蛋白对人     

Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析

在部分朊病毒病（prion diseases）中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prion protein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用. 本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点. 利用RT-PCR方法从人源细胞系SHSY5Y cDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX-2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GST-tau. 利用GST pull-down及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23-231的分子间相互作用. 进一步表达tau 蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点. 结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别. GST pull-down和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区. 上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT2的体外激酶活性分析

目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

人受精蛋白β整联蛋白配体区cDNA的克隆、表达及抗体制备

从人睾丸中抽提mRNA,合成双链cDNA,利用合成的PCR引物扩增受精蛋白β（fertilinβ）的整联蛋白配体区cDNA（hf279)。序列分析表明,该区编码93个氨基酸,与文献报道安全相同。将hf29插入质粒pGEX－4T－2,构建pGEX-hf279表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达菌株经IPTG诱导,可产生大量可溶性的表达蛋白GST－HF93。SDS－PAGE分析表明融合蛋白表观分子量为38kD,其含量占菌体可溶性蛋白的50％以上。表达产物经谷胱甘肽转硫酶（GST）亲和层析柱纯化,得到90％以上纯度的凳晤蛋白。融合蛋白经凝血酶切2h可得HF93肽。再经GST新和层析柱去除GST,得到纯度大于80％的HF93肽。将其和SDS－PAGE凝胶上切下的HF03多肽条带一起用于免疫BALB／c小鼠,经ELISA检测,证明获得了较高滴度的抗体。     

人干细胞生长因子Ca2+依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨

本作已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞。这一点与在Ca^2 依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同。本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能。由于该突变体序列GC含量较高．因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达。通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在。利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能。研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性。据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用。     

庚型肝炎病毒NS5 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为880bp的庚型肝炎病毒cDNA在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中得到表达。此cDNA被插入到表达质粒pGEX-5X-1中,位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的DNA序列下游,并与GST处于同一阅读框。用乳糖在37℃下诱导表达出以体形式存在的GST－NS53融合蛋白,并用脲溶法提取了该蛋白;在20℃诱导时,表达出的蛋白大部分可溶,用谷胱甘肽Sepharose－4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹实验证明,此融合蛋白能这臾型肝炎病人的血清和自制的扩GST在汪有特异性地识别。用PCgene软件对NS53氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析,本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。     

庚型肝炎病毒NS5 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为880 bp的庚型肝炎病毒cDNA在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达。此cDNA被插入到表达质粒pGEX-5X-1中,位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的DNA序列下游,并与GST处于同一阅读框。用乳糖在37℃下诱导表达出以包涵体形式存在的GST-NS53融合蛋白,并用脲溶法提取了该蛋白;在20℃诱导时,表达出的蛋白大部分可溶,用谷胱甘肽Sepharose-4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹实验证明,此融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清和自制的抗GST血清特异性地识别。用PCgene软件对NS53氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析。本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。     

P53与TRF1、TRF2的体外结合及P53结合功能区的分析

通过分析端粒结合蛋白TRF1、TRF2与P5 3的体外结合 ,探讨P5 3 端粒途径调节细胞生命活动的分子机制 .GST和 4种人P5 3 GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽 SepharoseTM4B纯化后 ,进行SDS PAGE和考马斯亮篮染色 .人P5 3包括野生型 (1～ 393)、C端缺失体P5 3N5 (2～ 2 93)、N端缺失体P5 32C(95～ 393)、单个氨基酸突变体P5 3R175H(175R→H) .各纯化蛋白的分子量与预计的完全一致 ,且纯化率达 90 %以上 .将纯化的GST和P5 3 GST融合蛋白与人乳腺癌细胞MCF 7细胞蛋白进行体外结合反应 ,Western印迹检测反应物中P5 3和TRF1、TRF2的结合 .野生型P5 3和P5 3 R175H均能沉淀MCF 7中的TRF1、TRF2 ,且结合力相似 ,而单独的GST则无沉淀TRF1、TRF2的作用 .与野生型P5 3和P5 3R175H相比 ,P5 32C与TRF1、TRF2的结合力明显增加 ,P5 3N5与TRF1、TRF2的结合力大大减弱 .表明P5 3和TRF1、TRF2可以进行直接而特异的体外结合 ,且它们的结合为P5 3C端 (2 93～ 393)结构域依赖性 .P5 3和TRF1、TRF2这种结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关 .     

鼠透明带3(ZP3)融合蛋白表达以及抗血清制备

鼠透明带3（mZP3)作为精子的初级受体,是鼠透明带中的一种主要糖蛋白,抗鼠透明带3抗体能够阻断精卵的结合,达到不育的效果,因此mZP3是免疫避孕研究的重要候选抗原。从小鼠卵巢中提取总RNA,分离mRNA,反转录获得cDNA,将cDNA连接到测序载体pUCm-T质粒上,通过序列测定和分析得到正确的mZP3 cDNA。经内切酶EcoR I和XhoI处理,将mZP3 cDNA克隆至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,在T4 DNA连接酶的作用下构建融合表达载体pGEX-mZP3,转化大肠杆菌BL－21菌株,利用IPTG诱导后获得可溶性的蛋白质产物,经过SDS－PAGE鉴定,表达的融合蛋白GST－mZP3分子质量约为72kD左右,纯化的融合蛋白免疫兔子,获得效价为1：1000的抗血清,Western blot检测抗血清具有针对mZP3融合蛋白的专一性,为进一步开展mZP3的免疫功能检测的研究奠定 了基础。     

无标签鼠疫耶尔森菌Ⅴ抗原突变体在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的:在大肠杆菌中表达、纯化无标签鼠疫耶尔森菌低钙反应V抗原突变体,并对其免疫原性进行研究。方法:采用融合PCR方法将Ⅴ抗原基因中编码半胱氨酸的碱基缺失突变,将获得得Ⅴ抗原突变体基因克隆到原核表达载体pET32a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并进行柱层析纯化,纯化产物以Western印迹进行鉴定并免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫血清效价。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性高表达,经三步柱层析后纯度高于95%,经Western印迹检测可与野生型V抗原单克隆抗体特异性结合,免疫小鼠后获得高效价免疫血清。结论:获得了无标签的鼠疫耶尔森菌Ⅴ抗原突变体蛋白,并证实其具有免疫原性,将对V抗原结构和功能的研究提供帮助。     

Th表位修饰的BLyS突变体的构建及活性分析

在已克隆可溶性BLyS(sBLyS)cDNA的基础上,经PCR构建了其缺失不同区域的突变体(msBLyS)cDNA,然后将msBLyScDNA与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)Th表位DNA序列重组,测序正确后分别克隆于原核表达载体pQE80L,并转化E.coliDH5α,经IPTG诱导后,融合蛋白以包涵体的形式表达,表达量均在菌体总蛋白的30%以上。包涵体经洗涤、溶解并经Ni-NTA层析纯化后,目的蛋白的纯度均在90%以上。活性检测发现,所获重组蛋白均丧失了sBLyS所具有的生物学功能,这些工作的完成为进一步探讨其治疗作用打下了基础。     

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipid transfer protein,nsLTP) LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较：pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A融合蛋白,但不能表达D45A和C50A融合蛋白;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21 (DE3) trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白,且表达量比在pTrxFus载体/GI724突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活,结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性。     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

草原兔尾鼠卵透明带3基因原核表达条件的优化

目的：通过大肠杆菌原核表达系统制备草原兔尾鼠卵透明带3（LZP3）融合蛋白,作为草原兔尾鼠疫苗免疫抗生育研究的抗原物质。方法：将LZP3基因的核心片段构建到融合表达载体pGEX-4T-1K中GST的3’端,形成GST-LZP3融合基因,经本科切鉴定和序列分析证实基因序列的正确性。在不同温度,不同时间和不同IPTG浓度进行诱导后,用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,发现有一条分子量约63kD的新增蛋白条带。结果：研究表明在37℃,25℃的不同温度条件下均能诱导出LZP3蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA法检测,初步证明了LZP3基因能够在大肠杆菌中有效表达可溶性的融合蛋白。结论：获得了LZP3融合蛋白表达的最佳诱导条件,为大量诱导产生LZP3融合蛋白奠定了理论基础。     

低毒且高效杀伤人肿瘤细胞的新型人肿瘤坏死因子突变体的构建

采用定点突变的方法构建了两株新型人肿瘤坏死因子突变体MT1 (32Trp157Phe)和MT2(2Lys30Ser32Trp157Phe), 并在大肠杆菌中得以高效表达, 表达量占菌体总蛋白的50%且为可溶性蛋白. 表达产物经蛋白印渍法检测, 均能与抗野生型hTNF-a单抗结合且经分离纯化后样品的纯度在95%以上. 各突变体虽然对鼠成纤维瘤细胞L929的生物学活性比野生型下降了4～5个数量级, 但却能高效杀伤人肿瘤细胞, 杀伤程度与野生型相差不明显. 测定突变体MT1的LD50值降至野生型的0.34%, 而MT2对小鼠30%致死剂量则低于野生型LD50的1/700.     

低毒且高效杀伤人肿瘤细胞的新型人肿瘤

采用定点突变的方法构建了两株新型人肿瘤坏死因子突变体MT1 (32Trp157Phe)和MT2(2Lys30Ser32Trp157Phe), 并在大肠杆菌中得以高效表达, 表达量占菌体总蛋白的50%且为可溶性蛋白. 表达产物经蛋白印渍法检测, 均能与抗野生型hTNF-a单抗结合且经分离纯化后样品的纯度在95%以上. 各突变体虽然对鼠成纤维瘤细胞L929的生物学活性比野生型下降了4~5个数量级, 但却能高效杀伤人肿瘤细胞, 杀伤程度与野生型相差不明显. 测定突变体MT1的LD50值降至野生型的0.34%, 而MT2对小鼠30%致死剂量则低于野生型LD50的1/700.     

小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化

利用PCR和基因重组技术构建了小嫌PC－1基因全长cDNA及其N端45个氨基酸残基的表达质粒pGEX-4T-1-mPC-1和pGEX-4T-1-mPC-1-45。经IPTG诱导后,在大肠杆菌DH5α中,GST－mPC-1和GST－mPC-1-45两个融合蛋白都获得了可溶性高表达。经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,获得了纯的GST－mPC-1和GST－mPC-1-45蛋白。