载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

真菌提取物JN219抗人巨细胞病毒机制的初步研究

目的探讨真菌提取物JN219的抗病毒机制。方法(1)样品对病毒入侵宿主细胞的抑制作用:将样品(JN219 50μg/ml、柱洗脱组分5 g/L)分别与人巨细胞病毒(HCMV半数组织感染量TCID50为105/ml)等容量混合,不同时间(混合后立刻、混合后37℃作用1 h)以不同稀释度、100μl/孔接种至多孔板人胚肺细胞(HEL)上;(2)样品对病毒复制的抑制作用:将HCMV(100个TCID50)100μl/孔接种于HEL上1 h后,加不同稀释度的样品;(3)灭活病毒对样品抗病毒作用的抑制作用:将紫外线灭活的HCMV与JN219、柱洗脱组分等容量混合,37℃作用1 h,加等容量HCMV(TCID50为105/ml)混合37℃作用1 h,以不同稀释度、100μl/孔接种于96孔板内的HEL上。以上各实验组同时设细胞对照组、病毒对照组、空白对照组、相应稀释度的样品对照组,37℃、5%CO2培养,每日观察细胞CPE,当病毒对照病变90%以上,终止培养,中性红染色,在540 nm读取吸光度A值,用Reed-Muench法计算细胞半数有效浓度(IC50)和病毒TCID50。通过比较组间差异,探讨在哪一复制周期样品对病毒产生抑制作用。结果(1)样品对病毒入侵宿主细胞的抑制作用:JN219、柱洗脱组分与HCMV等容量混合后立刻接种细胞,测得病毒TICD50为104.8/ml,与病毒对照组比较(TCID50为105/ml)差异无显著性;与病毒作用1 h后接种细胞,JN219、柱洗脱组分IC50分别为0.168μg/ml、0.185μg/ml,第一孔JN219 TCID50为101.6/ml,柱洗脱组分标本未测得病毒,可使HCMV得到抑制;(2)样品对病毒复制的抑制作用:先将病毒接种细胞1 h,然后加JN219、柱洗脱组分,IC50分别为3.29μg/ml、13.1 g/L,样品不能完全抑制人巨细胞病毒病变的发生;(3)灭活病毒对样品抗病毒作用的抑制作用:紫外线灭活的病毒与样品作用1 h,再加等容量病毒后接种细胞,样品JN219、柱洗脱组分与病毒混合物TCID50分别为103.5、103.75,样品抗病毒位点已被紫外线灭活病毒外膜蛋白占据,抗病毒效果降低。结论JN219抗人巨细胞病毒作用机制主要是阻断病毒入侵宿主细胞,作用位点主要为人巨细胞病毒外膜蛋白。     

PrP的胞内运输与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）,是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPc（cellular PrP）转化为异常构象的PrP^Sc（scrapie PrP）是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPc的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrP^C转化为PrP^Sc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrP^C的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。     

SIRT1在内皮细胞中抑制PMA和ionomycin诱导的ICAM-1的表达

白细胞在内皮中的富集能够引起炎症并触发动脉粥样硬化,intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)在该过程中发挥了重要作用.本实验室先前研究显示,内皮特异过表达Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1能够抑制动脉粥样硬化.因此,提出这样的假设:SIRT1能够抑制内皮细胞中ICAM-1的表达.实验发现,PMA和ionomycin(PMA/Io)能够在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中明显诱导SIRT1和ICAM-1的表达.而且,腺病毒介导的SIRT1过表达在HUVECs中能显著抑制PMA/Io诱导的ICAM-1的表达,而敲低SIRT1的表达则导致ICAM-1表达上调.双荧光素酶报告基因分析表明,过表达SIRT1抑制基础水平和PMA/Io诱导下的ICAM-1的启动子活性.进一步通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现,SIRT1参与转录复合物结合在ICAM-1启动子区,而且SIRT1的干扰能够提高NF-κB的亚基p65结合到ICAM-1启动子区的能力.总之,这些数据提示,SIRT1在内皮细胞中抑制ICAM-1表达的作用可能有助于其对抗动脉粥样硬化的发生.     

朊毒体病治疗对策的研究进展

朊毒体病又称传染性海绵状脑病(TSE),是一类人畜共患的慢性、致死性中枢神经系统退行性疾病,可表现为传染性、遗传性和散发性3种形式。朊蛋白PrP^c向PrP^Sc的转化以及PrP^Sc的复制是TSE致病的关键。目前已发现多种化合物可针对朊毒体扩散和复制的不同环节在体外或动物模型中发挥一定的抗朊毒体活性,其中几种药物已进行了初期临床试验。近年来PrP抗体的研究引起了人们广泛的兴趣,提示主、被动免疫可能成为有效的防治策略。     

山东肥城寒武纪竹叶状石灰岩菌群分析

为了探讨微生物活动与地层形成的关系,对山东肥城万灵山寒武纪竹叶状石灰岩中的微生物进行了培养分离,用PCR方法获得了它们的16S DNA序列,通过序列比对确定了这些微生物的种属,并对这些细菌进行了系统发育进化分析.结果 表明这些细菌属于芽胞杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)及未培养细菌(Uncultured bacterium),万灵山竹叶状石灰岩的微生物菌群分布以革兰阳性芽胞杆菌占优势.     

Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析

在部分朊病毒病（prion diseases）中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prion protein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用. 本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点. 利用RT-PCR方法从人源细胞系SHSY5Y cDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX-2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GST-tau. 利用GST pull-down及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23-231的分子间相互作用. 进一步表达tau 蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点. 结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别. GST pull-down和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区. 上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.     

jn219的分离纯化及其抗人巨细胞病毒活性的初步研究

目的:从真菌中分离纯化单峰物质,并对其抗人巨细胞病毒活性进行初步研究。方法:发酵获得菌丝体,通过丙酮/乙酸乙酯提取、硅胶柱层析、高效液相色谱制备,从菌丝体中获得单峰物质,经紫外光谱、质谱分析,采用细胞病变效应(CPE)抑制法,通过中性红染色计算病毒滴度,跟踪其抗病毒活性。结果:分离到的单峰物质(命名为jn219)紫外吸收峰为220nm,相对分子质量为519,半数中毒浓度(TD50)为50μg/mL,半数抑毒浓度(IC50)为1μg/mL,抑毒指数(TI)为50。结论:初步证实单峰物质jn219在体外具有抗人巨细胞病毒的活性。     

N端八肽重复区数目对人重组PrP与金属离子结合后的蛋白酶抗性及与tau蛋白结合能力的影响

人类朊病毒病中约10％～15％具有家族遗传特性,其中插入或缺失突变多发生于PrP蛋白N末端的八肽重复区域。运用PCR成功地构建并表达了含不同八肽重复数目的PrP蛋白,并观察八肽重复数目的增加对PrP与Cu^2＋等二价离子以及tau蛋白的相互作用的影响。实验结果显示：各种纯化后的PrP蛋白对常规浓度PK消化是敏感的,而与Cu^2＋共同孵育可使PrP蛋白的PK抗性增强;八肽重复序列的数目及Cu^2＋的浓度决定了PK抗性的出现和强弱。另外,MnH可诱导产生与CuH相似的结果,但其诱导效应似乎低于CuH,而Zn^2＋对PrP蛋白的PK抗性无影响。GST—tau包被的ELISA检测证实,重组的PrP呈现出明显的tau蛋白结合能力,并且与八肽重复序列的数量相关,重复序列数量越多,结合能力越强。这些结果提示,CuH诱导产生的PrP蛋白PK抗性是通过八肽重复序列区域产生的,并且直接与重复序列的数量相关。另外,PrP蛋白八肽重复序列的存在和数量直接影响PrP与tau蛋白的结合效应。除了八肽区域外,PrP蛋白其它区域似乎也具有一定的tau蛋白结合能力。