猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为60kD的融合蛋白GST-GP5-M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P56-ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为 94.1% ,表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P56-ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD_630nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。     

CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达,表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化,融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。     

H18杂交瘤抗凋亡能力的改造

利用PCR从pGEMTbcl-X_L质粒中获得bcl-X_L基因,构建真核表达载体pEF-bcl-X^{L,脂质体法转染杂交瘤细胞,G418筛选稳定表达株,Western blotting检测目的蛋白表达,流式细胞仪检测Bcl-X_L提高杂交瘤抗正丁酸钠诱导凋亡的功能。 将构建的编码鼠bcl-X_L基因的真核表达载体pEF-bcl-X_L,转染H18细胞后,获得稳定的表达株细胞;稳定表达Bcl-X_L的细胞具有抗正丁酸钠诱导凋亡的功能。鼠bcl-X_L基因在杂交瘤细胞中稳定表达,提高了杂交瘤抗凋亡的能力,对高密度大规模培养杂交瘤细胞具有重要意义。}     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用

利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌分枝杆菌(E.coliMycobacterium)穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S转移酶(Glutathione Stransferase,GST)抗原基因在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白(Heat shock protein,hsp)70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coliMycobacterium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coliMycobacterium穿梭表达质粒pBCG-2100。再将编码GST的cDNA按正确的阅读框顺序,克隆到pBCG-2100中hsp70启动子的下游,得到分枝杆菌表达质粒pBCG-GST。将pBCG-GST电转化入BCG中,筛选出重组BCG疫苗,经热诱导后所表达的重组GST(rGST)抗原,为可溶性蛋白,经纯化后,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带,其表达量占BCG菌体总蛋白的13%。Western blot提示rGST能与抗GST的抗体反应。     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达

以棉铃虫颗粒体病毒(Helicoverpa armigera granulosis virus,简称HaGV)基因组DNA为模板,设计引物PCR扩增病毒增效蛋白(Enhancin)基因,然后经SacI/PstI双酶切消化,得到5′端截短的约2.1kb增效蛋白基因片段,再与pQE30质粒连接,构建了重组表达载体pQE/EnC,转化大肠杆菌M15(pREP4),在IPTG诱导下表达出分子量约为78×10³ D的融合蛋白并命名为P78,纯化的P78包涵体显示了明显的增效活性,可提高AcMNPV对小菜蛾幼虫的感染率27.88%～32.92%。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 1000多个转化子依次在含不同G₄₁₈浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 24～ 28h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7.5 ,菌体密度OD₆₀₀ =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 160mg/L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 ,为大批量制备奠定了基础.     

类泛素家族SUMO-1和UBC9的克隆、融合表达及纯化

目的：克隆类泛素化家族SUMO-1和UBC9基因,表达并纯化二者与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增SUMO-1和UBC9的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-SUMO-1和pGST-UBC9,分别转化大肠杆菌DH5α,表达融合蛋白GST-SUMO-1和GST-UBC9;用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果：分别构建了SUMO-1和UBC9的融合表达载体;Western印迹检测表明,GST-SUMO-1和GST-UBC9融合蛋白获得表达;纯化得到了融合蛋白。结论：克隆、表达并纯化了SUMO-1和UBC9与GST的融合蛋白。     

新城疫病毒F蛋白中两段七肽重复序列的克隆和表达

从新城疫病毒 (NDV)中国强毒株F4 8E9和弱毒株长春株F蛋白的cDNA中亚克隆出两段七肽重复序列(HeptadRepeatRegion ,HR1,HR2 ) ,将HR1和HR2分别插入表达载体pGEX 6p 1,在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达 ,将与载体中的GST(GlutathioneS Trasferase)融合表达的可溶性融合蛋白用GST亲和层析柱纯化。纯化的融合蛋白用蛋白酶酶切后 ,先用GST亲和层析柱除去GST ,再加热进一步纯化。纯化的HR1和HR2质谱分析其分子量 ,结果表明 ,强株的HR1和HR2的分子量分别为 7 10 3kD和 6 3 0 1kD ,弱株的HR1和HR2的分子量分别为 7 10 7kD和6 3 0 9kD ,强弱株HR1和HR2的分子量都基本一致。本工作为研究HR1、HR2的结构以及它们在NDV与宿主细胞融合中的作用奠定了基础。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

Detection of foot-and-mouth virus antibodies using a purified protein from the high-level expression of codon-optimized, foot-and-mouth disease virus complex epitopes in Escherichia coli

A codon optimized DNA sequence coding for foot-and-mouth disease virus (FMDV) capsid protein complex epitopes of VP1 amino acid residues 21-40, 135-160, and 200-213 was genetically fused to the C-terminal end of a glutathione-S-transferase (GST) gene in pGEX-6P-1 vector with the synonymous codons preferred by Escherichia coli . The gene was synthesized using PCR and subsequently expressed in E. coli producing an intracellular, soluble fusion protein that retained antigenicity associated with FMDV antibodies by western blot analysis. The chimera was purified from bacterial lysates by affinity chromatography and could be used in ELISA tests for antibodies against FMDV.     

一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法

口蹄疫是一种一类传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV衣壳蛋白VP1含有中和性抗原表位。本研究合成了编码O型FMDVVP1蛋白中和性抗原表位的双拷贝DNA片段,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-1中,以获得的重组质粒转化大肠杆菌,然后用IPTG进行诱导,表达出了大小约为33kDa的GST融合重组蛋白,Westernblotting分析证实,重组蛋白可以被O型FMDV抗血清所识别。用纯化的重组蛋白免疫豚鼠制备高免血清,ELISA检测表明,免疫后的豚鼠血清抗体滴度可达1∶20560以上。本研究提供了一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法。     

棉铃虫组织蛋白酶B多克隆抗体制备及鉴定

介绍了用重组的棉铃虫组织蛋白酶B(HCB)制备兔多克隆抗体的方法。用已经克隆得到的pGEX 4T 1 HCB重组质粒转化的大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL2 1菌株进行诱导表达 ,获得融合表达的包涵体产物。经过变性、复性等方法处理包涵体 ,获得可溶性融合蛋白。用凝血酶裂解融合蛋白 ,再经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化目的蛋白HCB ,用做抗原免疫家兔。产生的抗血清经硫酸铵沉淀 ,最后得到了抗棉铃虫组织蛋白酶B的多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附测定法测得该抗体对重组表达的组织蛋白酶B和棉铃虫体内的组织蛋白酶B的效价分别为 1∶5 1 2 0 0和 1∶2 5 60 0。通过免疫印迹检测证明此抗体不仅可以识别重组表达的棉铃虫组织蛋白B ,而且可以识别棉铃虫卵巢匀浆液中的棉铃虫组织蛋白酶B。     

A recombinant antigen with potential for serodiagnosis of Echinococcus granulosus infection in dogs

Antibodies specific for Echinococcus granulosus were affinity purified from dog serum on transfer blots containing putative serodiagnostic antigens. These antibodies and serum pools derived from dogs with E. granulosus infections were used to screen a lambda gt11 cDNA library constructed using E. granulosus protoscolex mRNA. Nine definitive antigenic clones were isolated and characterized, of which one (c10P1) gave strong specific reactions in plaque immunoassay with sera from E. granulosus infected dogs. These clones were all subcloned into the plasmid vector pGEX-1. Antigenicity of clones was confirmed in colony immunoassay and/or immunoblot. Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins of individual subclones were produced in Escherichia coli, purified by affinity chromatography and evaluated in ELISA using sera from dogs with infections of E. granulosus, Taenia spp. or nematodes, and helminth-free dog sera. The GST fusion protein 10P1 showed a specificity of 100% in ELISA for diagnosis of E. granulosus infection in dogs despite its relatively low sensitivity. Further investigations aim to identify additional recombinant antigens and test 10P1 expressed in alternative expression systems to increase diagnostic sensitivity of the ELISA.     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达

目的:犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达,进而为其特异单克隆抗体的制备奠定基础。方法:以犬细小病毒VP2基因重组质粒为模板,通过蛋白质分析软件PROSPECT分析,根据VP2基因所编码的氨基酸的亲水性和抗原性,把VP2基因分成不同区段,设计相应引物并扩增出相应片段。按常规方法克隆入pGEX-4T-2载体谷光甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳。所得可溶性蛋白再经间接ELISA、western Blotting鉴定。结果:K2和K4片段获得了良好的可溶性表达,其表达的GST融合蛋白的分子质量分别为38.3 KD和41 KD,ELISA、Western Blotting结果表明所表达的融合蛋白具有与CPV阳性抗体特异结合的良好抗原性。结论:犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的获得了高效可溶性表达。     

p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响,应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变,并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体,并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．最后经纯化得到了野生和Ｐ４８Ｌ突变的ｐ１６融合蛋白