鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

感染羊瘙痒因子263K株或139A株仓鼠脑组织中tau蛋白和磷酸化tau蛋白变化的研究

为探讨朊病毒病的神经病理特征,应用Western blot方法检测了感染羊瘙痒因子263K株或139A株的仓鼠脑组织中总tau蛋白和Ser396和Ser404位点发生磷酸化tau蛋白表达水平的变化;并应用Real Time PCR方法检测了tau mRNAs转录活性的改变。结果表明总tau蛋白含量升高而Ser396和Ser404位点发生磷酸化的tau蛋白含量降低,该现象与羊瘙痒因子毒株类型和临床潜伏期无关;感染羊瘙痒因子的仓鼠脑组织中Tau2和Tau4这两个异构体的转录水平升高。这些结果表明tau蛋白在Ser396和Ser404位点的去磷酸化可能与朊病毒病发病相关。     

微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用

微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白(PrP)之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白(PrP^C)和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白(PrPSc)相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrPC和PrPSc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列(23~91 aa). PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.     

载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

羊瘙痒病263K毒株感染的仓鼠脑中PrP分子形式多样性的动态测定

正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的根本原因。将羊瘙痒病(scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠,在接种后的第20、40、50、60、70、80天,通过Westernblot动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式。结果在接种后第40天,在感染动物脑组织中即检测到PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66 7±1 1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显。除了标准分子量大小(30kD～35kD)的PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子。定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关。蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的PrP分子。低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式。结果提示,scrapie263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物。     

一些化学和物理因素对羊瘙痒因子263K蛋白酶抗性的影响

朊病毒(prion)具有超强的理化因素抵抗能力,可抵抗常规物理和化学因子对其感染性的灭活.为了研究不同理化因素对PrPSc蛋白酶抗性的影响,采用不同浓度的NaOH、NaOCl、SDS、温度变化以及3%SDS与温度变化联合处理羊瘙痒因子263K,再经蛋白酶K(Proteinase K,PK)消化,通过Western blot检测观测PrPSc的PK抗性.结果发现,上述几种理化因素对羊瘙痒因子263K的PK抗性有不同程度的破坏作用.NaOH浓度在0.05mol/L以上,NaOCl游离氯含量在0.1%以上,温度在121℃以上都能使PrPSc的PK抗性消失;而1%～5%SDS不能使PrPSc的PK抗性完全消失,3%SDS与温度的联合作用可有效地破坏PK抗性,同时使所需温度降低.还发现,在较低浓度的化学因子或温度的条件下即可出现PK抗性的破坏,而在较高浓度或温度处理时才出现蛋白本身的消失.这些结果提示,与PrPSc感染性的结果相似,PK抗性可受相似浓度或强度的理化因素影响,具有明显的浓度或强度相关性,对判定消除PrPSc的感染性有一定的指导意义.     

一种基于连续PMCA的PrPSc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测.结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制.连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc.     

细胞浆中PrP蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

为了探讨在胞浆中表达的PrP的理化特征以及对细胞活性的影响,我们构建了胞浆型PrP(CytoPrP)真核表达质粒,瞬时转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,通过蛋白酶敏感性实验检测CytoPrP及其蛋白酶抗性,利用MTT和Trypan Blue细胞计数检测CytoPrP的细胞毒性作用.结果显示,CytoPrP在胞浆内的存在受蛋白酶抑制剂的控制;与野生型PrP相比,CytoPrP具有相对较强的蛋白酶K(PK)抗性.MTT和细胞计数实验均显示,Cyto-PrP的存在可诱导明显的细胞毒性效应,而CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响,呈剂量依赖关系.上述结果为研究CytoPrP在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的科学数据.     

PrP的胞内运输与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）,是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPc（cellular PrP）转化为异常构象的PrP^Sc（scrapie PrP）是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPc的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrP^C转化为PrP^Sc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrP^C的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。     

EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS)。将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移。将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆。为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降。证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运。