日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能,本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增,获得Lj-RGD1的420 bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后,获得分子量为169 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集,IC50为123 μmol/L;血管新生抑制实验结果表明,rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡,抑制ECV304细胞增殖和管状物形成,并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）血管新生.由此可见,Lj-RGD1具有去整合素样生物活性,在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.     

利用定量杂交法检测绵羊瘤胃纤维细菌的研究*

实验利用通用细菌探针和3株纤维分解菌的特异性探针,初步建立起对瘤胃细菌进行检测的16S rRNA定量杂交的方法。试验将提取的总RNA按浓度系列稀释后与通用细菌探针进行杂交,检测结果所做的回归分析表明,杂交信号与尼龙膜上的所点RNA的量具有明显线性关系。同时对几份瘤胃样品进行3种纤维分解菌的初步定量检测,结果显示3种纤维分解菌的相对丰度与前人报道相似,表明该方法能够对瘤胃细菌进行定量分析,可在后续相关研究中使用。     

重组白眉蝮蛇去整合素定点突变对其生物活性的影响

RGD为存在于许多糖蛋白配体中的氨基酸序列,对整合素具有识别作用.此序列也发现于许多蛇毒去整合素分子中.采用基因克隆技术从大连产白眉蝮蛇的毒腺中克隆出的去整合素adinbitor是含73个氨基酸残基的去整合素,分子中含有12个半胱氨酸和RGD模体.实验证明,adinbitor作为去整合素的新成员,具有典型的抗ADP诱导的人血小板聚集作用和抗肿瘤血管新生作用.为了将adinbitor的这2种功能分开,采用PCR基因定点突变的方法,将其cDNA序列中RGD模体改变成KGD.重组adinbitor(KGD)在E.coli BL21得到表达,并通过His•Bind亲和层析予以纯化.实验发现,adinbitor对ADP诱导的人血小板聚集具有明显抑制作用,其IC50=85 nmol/L,明显优于adinbitor(RGD) （IC50=150 nmol/L）.然而,与adinbitor(KGD)相比,adinbitor(KGD)则丧失了对血管生成的抑制作用.结果说明,adinbitor(KGD)可作为专一的抗人血小板聚集药具有潜在的开发前景.     

rLj-RGD3全RGD缺失基因重组突变体——rLj-112的分子克隆及其广谱抑真菌活性

Lj-112是日本七鳃鳗RGD毒素蛋白野生型Lj-RGD3的RGD全缺失基因突变体,其一级结构具有富组氨酸的特点．富组氨酸糖蛋白具有抑菌功能．为了研究Lj-112是否具有抑菌作用,使用基因合成和原核表达的方法,获得了纯化重组蛋白rLj-112,将其对不同菌种进行抑菌试验.结果表明,以野生型rLj-RGD3、RGD模体与组氨酸全缺失突变体rLj-26为对照,rLj-112有较广谱的抑菌活性,其中对白念球菌的最低抑菌浓度（MIC）为7 μmol/L,对稻瘟病菌的MIC值为7.5 μmol/L,对毛癣菌和禾谷病菌的MIC值分别为11.9 μmol/L和29.9 μmol/L．可见,rLj-112能作为抗真菌药物候选,为提高农作物的生产质量和减轻人类感染疾病的用药压力奠定了基础．     

日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD,是含有2个RGD（Arg-Gly-Asp）模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能,对其基因进行了克隆和表达,并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA,以自行设计的引物进行RT-PCR扩增,以获得Lj-RGD2基因;将获取的目的基因与pET23b载体连接,经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定;将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达;经亲和层析纯化,获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白,并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示,rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L,并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖;rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF（basic fibroblast growth factor）为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM（chick chorioallantoic membrane）血管新生实验结果表明,rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见,rLj RGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征,其有望成为一种抗血管新生基因工程新药. 关键词日本七鳃鳗; RGD毒素蛋白; 细胞黏附; 迁移及侵袭; 血管新生     

日本七鳃鳗Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型与RGD全缺失突变体Lj-112的抗血管新生作用

七鳃鳗Arg-Gly-Asp (RGD) 毒素肽Lj-RGD3与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性,而RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同。为研究Lj-RGD3结构与功能的关系,对野生型Lj-RGD3及其RGD全缺失突变体Lj-112进行了抗血管新生功能研究。将3个RGD模体的全缺失突变体基因Lj-112全序列合成后构建于pET-23b载体,对野生型Lj-RGD3及突变体 Lj-112蛋白进行IPTG诱导表达,重组蛋白经组氨酸亲和层析纯化;采用MTT法测定野生型和突变体蛋白对人     

心肌酶和红细胞形态学参数与心肌梗死的相关性研究

目的:研究红细胞形态学参数对心肌梗死患者诊断作用及其与心肌酶谱的相关性。方法:选取40例心肌梗死患者,40例稳定型心绞痛组患者,40例健康对照组人群。对比分析稳定性心绞痛、急性心肌梗死(入院1h内)和对照组红细胞形态学参数(MCV、MCH、MCHC、RDW)、及心肌酶谱(CK-MB、c Tn I)。分析心肌梗死不同时间MCV、MCH、MCHC、RDW变化趋势。结果:稳定性心绞痛、心肌梗死组1 h内MCV、RDW明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05);稳定性心绞痛、心肌梗死组1 h内MCHC、MCH低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。心肌梗死组MCV、RDW在发病后1 h、24 h、48 h、7 d水平逐渐升高,各时间点间差异有统计学意义(P0.05)。心肌梗死组发病后1 h、24 h、48 h、7 d、14 d MCHC、MCH水平逐渐降低,各时间点间差异有统计学意义(P0.05)。RDW和CK-MB、c Tn I呈正相关性(P0.05)。RDW对心肌梗死诊断的灵敏度最高达到93.4%,特异度为69.7%,RDW对急性心肌梗塞的诊断临界值为14.04%。结论:RDW对心肌梗死的诊断具有较高的敏感性,可用于临床早期诊断心肌梗死,为临床诊断提供一新的诊断标准。     

利用定量杂交法检测绵羊瘤胃纤维细菌的研究

实验利用通用细菌探针和3株纤维分解菌的特异性探针,初步建立起对瘤胃细菌进行检测的16SrRNA定量杂交的方法。试验将提取的总RNA按浓度系列稀释后与通用细菌探针进行杂交,检测结果所做的回归分析表明,杂交信号与尼龙膜上的所点RNA的量具有明显线性关系。同时对几份瘤胃样品进行3种纤维分解菌的初步定量检测,结果显示3种纤维分解菌的相对丰度与前人报道相似,表明该方法能够对瘤胃细菌进行定量分析,可在后续相关研究中使用。     

重组七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白rLj-RGD1对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

rLj-RGD1为源于日本七鳃鳗口腔腺的基因重组蛋白,其富含半胱氨酸并具有一个RGD(Arg-Gly-Asp)模体.前期工作表明,rLj-RGD1具有抑制血小板聚集及血管新生的RGD毒素蛋白典型功能.为了研究rLj RGD1是否具有RGD毒素蛋白的另一典型抗肿瘤功能,以人肝癌HepG2细胞为模型,对rLj RGD1进行了活性研究.MTT法结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制HepG2细胞的增殖,其半抑制浓度(IC50)为36 μmol/L;细胞迁移与浸润实验结果显示,rLj-RGD1能以剂量依赖方式抑制HepG2细胞碱性成纤维生长因子（bFGF）诱导的迁移与浸润.Hoechst染色和DNA Ladder等细胞凋亡实验表明,rLj-RGD1能够以剂量依赖方式诱导HepG2细胞发生凋亡.细胞黏附实验表明,rLj-RGD1以剂量依赖方式抑制HepG2细胞与玻连蛋白(vitronectin, VN)的黏附.上述结果表明,rLj-RGD1具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖、迁移和浸润的功能,并可诱导其发生失巢凋亡. 本研究结果提示,rLj-RGD1具有典型的RGD毒素蛋白抗肿瘤功能,其未来具有成为抗肿瘤药物的潜力.