登革病毒2型全长cDNA感染性转录体的构建和鉴定

为构建登革病毒感染性克隆, 针对登革病毒2型基因组全长cDNA的体外转录方法及感染性转录体进行研究。采用长链RT-PCR技术, 扩增DEN2 NGC株全长基因组cDNA, 以之为模板, 用SP6 RNA聚合酶系统制备体外转录RNA转录体, 分别经乳鼠脑内接种及电穿孔转染BHK-21细胞, 观察其感染效应。并从受染鼠脑和病变细胞中提取总RNA, 进行RT-PCR扩增、克隆测序以及电镜观察。结果发现, 从感染鼠脑和细胞中经RT-PCR均可扩增出病毒特异的基因片段, 大小与预期一致; 并从乳鼠脑组织和BHK-21细胞中观察到恢复病毒颗粒。上述结果表明本文成功构建的DEN2 NGC株病毒全长cDNA的体外转录体具有感染性, 乳鼠脑内接种途径与电穿孔转染细胞一样可成为体外转录体感染宿主细胞、获得恢复病毒的方法。     

流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得

根据JEV病毒减毒株SA14—14—2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT—PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR—kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT—PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。     

SARS-CoV 中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS-CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS-CoV的致病机制,将覆盖SARS-CoVBJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入VeroE6细胞,可观察到典型的SARS-CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS-CoVBJ01株原病毒序列一致。以针对SARS-CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度,结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS-CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。     

SARS-CoV 中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS_CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS_CoV的致病机制,将覆盖SARS_CoV BJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用 T7 RNA 聚合酶系统在体外进行转录, 获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入Vero E6细胞,可观察到典型的SARS_CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用 RT_PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS_CoV BJ01株原病毒序列一致。以针对SARS_CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度, 结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS_CoV BJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS_CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。     

从PRRSV BJ-4株基因组全长cDNA获得感染性病毒

对已构建的覆盖猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ-4全长cDNA的6个重组质粒进行测序,并对部分点突变进行定点回复突变,将突变片段顺次连接,获得了全长cDNA克隆pWSK-DCBA。通过体外转录获得病毒基因组RNA,将RNA与脂质体混合后直接转染MARC-145细胞,获得拯救病毒(rV68)。rV68能在MARC-145细胞上稳定传代,并可引起PRRSV特征性的细胞病变(CPE)。增殖动态分析表明,rV68在MARC-145细胞上的生长有所迟滞,达到最高滴度的培养时间比亲本病毒延迟12h,但滴毒无显著差异(P>0.05)。结果表明,构建的BJ-4全长cDNApWSK-DCBA具有感染性,为研究中国PRRSV的分子致病与免疫机制、新型疫苗等奠定了基础。     

XJ-160病毒单方向血清学反应分子基础研究

本研究通过基因替换和重组等技术构建重组病毒解释XJ-160病毒单方向血清学反应的分子基础。以实验室构建的XJ-160病毒全感染性克隆为基础获得XJ-160病毒和辛德毕斯病毒(SINV)糖蛋白基因单独和同时相互替换的重组病毒。首先研究重组病毒对细胞及动物感染性和致病性,同时利用微量细胞中和试验方法鉴定引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段。研究结果显示XJ-160病毒E2糖蛋白是影响病毒在细胞中的生长速率,空斑形态及对乳鼠致病性的主要因素。中和试验结果显示SIN病毒E2糖蛋白对决定引起XJ-160病毒单方向血清学反应起着重要作用。本研究确定了引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段,并为进一步研究XJ-160病毒基因组结构与功能打下了基础。     

Generation of an infectious clone of VR-2332, a highly virulent North American-type isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

A full-length cDNA clone of the prototypical North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolate VR-2332 was assembled in the plasmid vector pOK(12). To rescue infectious virus, capped RNA was transcribed in vitro from the pOK(12) clone and transfected into BHK-21C cells. The supernatant from transfected monolayers were serially passaged on Marc-145 cells and porcine pulmonary alveolar macrophages. Infectious PRRSV was recovered on Marc-145 cells as well as porcine pulmonary macrophages; thus, the cloned virus exhibited the same cell tropism as the parental VR-2332 strain. However, the cloned virus was clearly distinguishable from the parental VR-2332 strain by an engineered marker, a BstZ17I restriction site. The full-length cDNA clone had 11 nucleotide changes, 2 of which affected coding, compared to the parental VR-2332 strain. Additionally, the transcribed RNA had an extra G at the 5' end. To examine whether these changes influenced viral replication, we examined the growth kinetics of the cloned virus in vitro. In Marc-145 cells, the growth kinetics of the cloned virus reflected those of the parental isolate, even though the titers of the cloned virus were consistently slightly lower. In experimentally infected 5.5-week-old pigs, the cloned virus produced blue discoloration of the ears, a classical clinical symptom of PRRSV. Also, the seroconversion kinetics of pigs infected with the cloned virus and VR-2332 were very similar. Hence, virus derived from the full-length cDNA clone appeared to recapitulate the biological properties of the highly virulent parental VR-2332 strain. This is the first report of an infectious cDNA clone based on American-type PRRSV. The availability of this cDNA clone will allow examination of the molecular mechanisms behind PRRSV virulence and attenuation, which might in turn allow the production of second-generation, genetically engineered PRRSV vaccines.     

辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建

To construct vector system of XJ-160 virus,a Sindbis virus isolated in China,recombinant vector pBRepXJ together with its helper plasmid pBR-H were derived from XJ-160 viral infectious clone pBR-XJ160 by overlap-PCR.To quantitatively and qualitatively verify the function of the replicon system,recombinant plasmids pSinRep-EGFP,pBRepXJ-EGFP,pSinRep-R and pBRepXJ-R were constructed by cloning report genes of enhanced green fluorescent protein(EGFP) or Renilla luciferase(R.luc) into pBRepXJ or pSinRep5,a comme...     

含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

摘要：【目的】构建含有RGD受体结合位点口蹄疫病毒（FMDV）Asia1/JS/China/2005株的全长感染性cDNA克隆。【方法】采用定点突变方法,构建Asia1型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD。pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救。【结果】序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asia1/JS/China/2005全长cDNA克隆。共转染实验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asia1/JS/China/2005株FMDV。【结论】该实验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础。     

含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

[目的]构建含有精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸(RGD)受体结合位点口蹄疫病毒(FmDV)Asial/JS/Chind2005株的全长感染性cDNA克隆.[方法]采用定点突变方法,构建Asial型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD.pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒peDNATIP共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救.[结果]序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asial/JS/China/2005全长cDNA克隆.共转染试验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asial/JS/China/2005株FMDV.[结论]该试验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础.