XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

黄病毒属病毒复制子载体研究进展

RNA复制子是一种能自主复制的RNA载体,保留了病毒非结构蛋白(复制/转录酶)基因,而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代,复制/转录酶可控制载体RNA在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达。在黄病毒属病毒感染性克隆基础上,其复制子载体得到了成功的构建。黄病毒属病毒复制子为病毒基因组结构功能研究、表达载体构建、假病毒包装及新型疫苗制备等提供了新的技术平台。本文综述黄病毒属病毒复制子的构建原理、方法及应用。     

鹅源新城疫病毒ZJ1株微型基因组的构建及其初步应用

在获得鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列的基础上,用增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因取代鹅源新城疫病毒ZJ1株整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒粒子包装相关的调控序列,将其反向克隆入转录载体TVT7R(0.0)中,构建了该毒株的微型基因组。当转染用辅助病毒ZJ1株感染的Hep_2细胞时报告基因得到表达,表明此微型 基因组RNA可被辅助病毒提供的NP、P和L蛋白翻译。同时将该病毒NP、P和L蛋白基因分别克隆入真核表达载体pCI_neo中,构建了表达该病毒NP、P与L蛋白的辅助质粒,用此微型基因组对辅助质粒的表达产物进行了功能鉴定并对该病毒拯救过程中痘苗病毒的最适感染剂量进行了摸索。以上研究为该病毒的成功拯救及开展其它相关研究奠定了基础。     

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.     

nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响

为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ-160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A。将新霉素抗性基因(Neomycinr,Neor)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响。实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快。替换突变nsP2-726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力。而pBRep-726S则具有中间表型。提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程。这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础。     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

日本脑炎病毒C蛋白对其复制子载体自主复制活性的影响

为了研制具有高效自主复制能力的日本脑炎病毒 (JEV) 复制子载体,验证其作为新型复制子疫苗载体的可能性。以保留全长核心蛋白C基因的JEV复制子载体pCTCJEV为基础,通过PCR的方法减短C蛋白的部分基因序列,分别保留C23和C68位氨基酸,以Lac Z基因作为报告基因,构建了C基因长短不同的JEV复制子载体pCMW-2M-1LACZ、pCMW-2M-3LACZ。将复制子载体转染表达JEV结构蛋白的细胞系CME-4,通过Lac Z的表达检测JEV复制子载体表达外源蛋白的能力,反映了JEV的系列复制子载体的自主复制能力。结果保留C基因全长,C68、C23的复制子载体表达外源蛋白的能力相当,以上结果说明仅仅保留C蛋白的69个核苷酸即可保留JEV复制子载体的自主复制能力,为进一步优化JEV复制子载体,将该载体开发研制成为高效表达外源蛋白的疫苗载体提供了依据。     

利用脊髓灰质炎病毒5''''NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。     

一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。     

Polypeptide composition of flacherie viruses of the silkworm

The purified flacherie viruses of the silkworm, Bombyx mori, (FVS I, FVS II, FVS III, and FVS IV) were iodinated by using chloramine-T. The iodinated FVSes were purified by sucrose density gradient centrifugation or 2.4% polyacrylamide gel electrophoresis. FVS IV was found in the sedimentation analysis of FVS I, FVS II, and FVS IV. Electrophoretic patterns of FVS IV showed that it was a mixture of components having identical mobilities with FVS I, EVS IIa, and FVS IIb. FVS IV was a decomposed particle of FVS I, FVS II, and/or FVS III. All of these particles contained three polypeptides with molecular weights of about 51,000, 31,000, and 12,000 daltons. FVS I composed of six polypeptides with molecular weights of 67,000, 51,000, 39,000, 31,000, 14,000, and 12,000 daltons. The maturation process of FVS I was discussed and was suggested as the following process, FVS IIb→FVS IIa→FVS I. It is not clear whether FVS III is an intermediate for FVS IIa to convert into FVS I, or FVS III is a decomposed particle of FVS I.     

RNA viruses in the sea

Viruses are ubiquitous in the sea and appear to outnumber all other forms of marine life by at least an order of magnitude. Through selective infection, viruses influence nutrient cycling, community structure, and evolution in the ocean. Over the past 20 years we have learned a great deal about the diversity and ecology of the viruses that constitute the marine virioplankton, but until recently the emphasis has been on DNA viruses. Along with expanding knowledge about RNA viruses that infect important marine animals, recent isolations of RNA viruses that infect single-celled eukaryotes and molecular analyses of the RNA virioplankton have revealed that marine RNA viruses are novel, widespread, and genetically diverse. Discoveries in marine RNA virology are broadening our understanding of the biology, ecology, and evolution of viruses, and the epidemiology of viral diseases, but there is still much that we need to learn about the ecology and diversity of RNA viruses before we can fully appreciate their contributions to the dynamics of marine ecosystems. As a step toward making sense of how RNA viruses contribute to the extraordinary viral diversity in the sea, we summarize in this review what is currently known about RNA viruses that infect marine organisms.     

Evidence for plant viruses in the region of Argentina Islands, Antarctica

This work focused on the assessment of plant virus occurrence among primitive and higher plants in the Antarctic region. Sampling occurred during two seasons (2004/5 and 2005/6) at the Ukrainian Antarctic Station 'Academician Vernadskiy' positioned on Argentina Islands. Collected plant samples of four moss genera (Polytrichum, Plagiatecium, Sanionia and Barbilophozia) and one higher monocot plant species, Deschampsia antarctica, were further subjected to enzyme-linked immunosorbent assay to test for the presence of common plant viruses. Surprisingly, samples of Barbilophozia and Polytrichum mosses were found to contain antigens of viruses from the genus Tobamovirus, Tobacco mosaic virus and Cucumber green mottle mosaic virus, which normally parasitize angiosperms. By contrast, samples of the monocot Deschampsia antarctica were positive for viruses typically infecting dicots: Cucumber green mottle mosaic virus, Cucumber mosaic virus and Tomato spotted wilt virus. Serological data for Deschampsia antarctica were supported in part by transmission electron microscopy observations and bioassay results. The results demonstrate comparatively high diversity of plant viruses detected in Antarctica; the results also raise questions of virus specificity and host susceptibility, as the detected viruses normally infect dicotyledonous plants. However, the means of plant virus emergence in the region remain elusive and are discussed.     

Early onset of virus infection and up-regulation of cytokines in mice treated with cadmium and manganese

A substantial database indicates that a large number of environmental pollutants, chemicals and therapeutic agents to which organisms are exposed cause immunotoxicity. The suppression of immune functions may cause increased susceptibility of the host to a variety of microbial pathogens potentially resulting in a life-threatening state. Evaluation of the immunotoxic potential of chemical xenobiotics is of great concern and, therefore, we have investigated the impact of exposure of inorganic metals, specifically cadmium (Cd) and manganese (Mn) on Encephalomyocarditis virus (EMCV), Semliki Forest virus (SFV), and Venezuelan Equine Encephalitis virus (VEEV) infection. Pretreatment with a single, oral dose of Cd or Mn increased the susceptibility of mice to a sub-lethal infection of these viruses as observed by increased severity of symptoms and mortality compared to untreated controls. An early onset of virus infection was found in brains of Cd and Mn treated animals. Histopathological observations of the brain indicate evidence of inflammation and greater tissue pathology in Cd-or Mn-exposed mice compared to control animals. Meningitis and vascular congestion was seen in virus infected mice in all the metal treated groups, and further, the perivascular inflammation appeared earlier in treated mice compared to control. Encephalitis was maximum in Cd pretreated mice. Widespread environmental contamination of metals and the potential for their exposure and subsequent infection of humans or animals is indicative that further studies of these and all other metals are important to understand the effect of environmental pollution on human health.     

寨卡病毒及其疫苗研究

寨卡病毒与黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒等都属于蚊媒传播的黄病毒属病毒。寨卡病毒分离于1947年,但由于分布区域有限,所致寨卡热症状较轻,很长一段时间并没有引起太多的关注。最近一些年,特别是2015年后,巴西的寨卡疫情暴发及其与新生儿小头畸形的关联,引起了全球越来越多的关注。疫苗是应对寨卡疫情的重要手段,目前全球有30余个机构在进行寨卡病毒疫苗的研发。本文综述了寨卡病毒的生物学、流行病学、临床特征以及当前不同类型寨卡病毒疫苗研发现状,同时对其他几种黄病毒属病毒批准和临床阶段疫苗情况进行了概述,以为相关研究人员提供参考。     

应用斑点法检测植物病毒的研究

应用斑点法检测了病叶粗汁液中的芜菁花叶病毒(TuMV)、大豆花叶病毒(sMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),病叶粗汁液可被检测的最大稀释度分别为1:5120、1:2560和1:1280。提纯的大豆花叶病毒和黄瓜花叶病毒可检测的最低限量分别为1.7ng和1.2ng。以牛血清白蛋白、吐温和聚乙烯吡咯啉酮作封闭液,均可获得满意的结果。应用斑点法检测芜菁花叶病毒和大豆花叶病毒时,其抗血清稀释1:500倍可获得满意效果,稀释2000倍仍可用于检测。     

肝炎病毒与EB病毒重叠感染

为探讨肝炎病毒（ＨＶ）与ＥＢ病毒（ＥＢＶ）重叠感染的状况和后果,我们用免疫酶法对１５４例各型病毒性肝炎患者作了ＥＢＶＩｇＡ抗体检测。结果发现,急性肝炎、慢性轻度肝炎、慢性中度肝炎、肝炎肝硬化、慢性重型肝炎和原发性肝癌ＶＧＡ－ＩｇＡ抗体的阳性率分别为２４．０％、３０．０％、５３．３％、６３．３％、４０．０％和７２．７％,与健康人（５．３％）比较,有非常显著升高（Ｐ＜０．０１）;原发性肝癌又较急性肝炎和慢性轻度肝炎高,并有非常显著意义差异（Ｐ＜０．０１）。ＨＢＶ和ＨＡＶ＋ＨＢＶ感染者比较,前者又较后者低（Ｐ＜０．０１）。重叠感染者的临床表现均为“肝炎型”,未见咽炎、腺热、胃肠、肺炎、肾炎、神经等类型。重叠感染者的ＣＤ＋３及ＣＤ＋４Ｔ细胞下降,ＣＤ＋８Ｔ细胞及ＩｇＧ,ＩｇＭ升高,与健康人比较差异非常显著意义（Ｐ＜０．０１）。结果提示：ＨＶ感染,不仅因免疫失调易感ＥＢＶ,又可因重叠感染而进一步使免疫功能失调;对病毒性肝炎的处理应强调免疫调节治疗。