肝素对逆转录抑制作用的研究

目的:研究肝素在逆转录过程中的作用.方法:提取人肺胚胎二倍体细胞和肝素抗凝血中总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量好后,逆转录合成相应的cDNA,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用基因芯片技术检测cDNA.将肝素抗凝血中提取的总RNA分为等量的两部分,分别用肝素酶或氯化锂处理RNA进行逆转录为cDNA和RNA合成cDNA后再用肝素酶或氯化锂处理,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;并用基因芯片技术检测氯化锂处理RNA后cDNA.结果:二倍体细胞来源的RNA为模板,能扩增出β-actin产物,并且在基因芯片上有杂交点.肝素抗凝血来源的RNA,在肝素酶或氯化锂作用后行逆转录者,能扩增到β-actin的目的片段,且基因芯片上有杂交点;而在未处理者不能扩增到目的片段,且基因芯片上无杂交点.结论:肝素是一种逆转录的抑制剂.对RNA逆转录cDNA过程有较强的抑制作用.     

骨组织总RNA的提取技术

目的探讨Trizol试剂提取骨组织总RNA的技术方法。方法采用高速均质仪进行组织粉碎处理,用Tr-izol试剂提取RNA后,分3组进行RNA纯化处理,并通过紫外分光光度计、电泳、Real-time PCR等方法验证RNA的质量。结果用Tirzol试剂从经粉碎处理的骨组织中所提取的总RNA纯度差,只有再进行DNase1消化及有机溶剂再纯化后,才能保证所提RNA完整且纯净。结论从组织中提取的总RNA经DNase1消化及有机溶剂抽提,可提高RNA质量;另外实验证实用紫外分光光度法判断RNA的质量有许多局限性,利用琼脂糖电泳及Real-time PCR方法也能很简便的判断RNA质量。     

一种高效提取猕猴桃DNA和RNA的方法

在总核酸提取方法(PS法)的基础上,经多次实践改进,得出一种以高盐低pH的HAc-NaAc缓冲体系提取总核酸的简便方法,可以从富含多糖、多酚时猕猴桃叶片和花蕾中提取同时含有DNA和RNA的总核酸.所得的总核酸在LiCl溶液中选择性沉淀RNA,从而有效地分离出DNA和RNA样品.紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分析表明,所提取的DNA和RNA具有较高的纯度和完整性.通过样品DNA的PCR和样品RNA的RT-PCR,认为所提取的DNA样品和RNA样品能够满足分子生物学试验的基本要求.     

碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证

目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础.方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定.结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有Rnase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符.结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求.     

四种副溶血弧菌总RNA提取方法的比较

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌.提取高质量的RNA是研究副溶血弧毒力基因表达与其致病性和环境适应性的基础.本研究分别用SDS法、Trizol法,PureLinkTM RNA Mini Kit和Uniq-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取六株副溶血弧菌的总RNA,用普通琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪检测RNA的质量,并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较.研究结果表明,Trizol法和PureLinkTM RNA Mini Kit简单快捷,提取的总RNA完整性好,纯度高,可用于后续实验的分子生物学研究;而Trizol法更适用于普通实验室细菌RNA的提取.     

淡水育珠蚌外套膜提取总RNA的改良方法

通过对Trizol法加以改进,提取淡水珍珠蚌外套膜组织中的总RNA。经预处理后,在异丙醇沉淀RNA时加入高浓度的盐溶液,用75%的酒精2次洗涤RNA。用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA。结果表明,改良法获得的总RNA完整、纯度高,改良Trizol法是一种从淡水育珠蚌外套膜组织中提取总RNA的高效、便捷、可靠的方法。     

一种简易高效提取多种植物纯净DNA的方法

植物组织中次生代谢产物较多,要从中快速提取高质量的DNA比较困难。本文利用一种改良的CTAB法,通过在裂解后直接添加RNase A去除RNA污染,然后再经过一系列的抽提、沉淀、洗涤,获得纯净的DNA。经用琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪检测总DNA的纯度、浓度及质量。以提取的DNA为模版,PCR能够获得清晰的目的条带。结果表明通过该法可以简易、快速、高通量的提取多种植物的纯净DNA,为后续的分子生物学分析奠定了技术基础。     

白腐真菌总RNA提取方法的研究

为寻求一种简便有效的白腐真菌总RNA的提取方法,在实验中分别采用Trizol试剂盒法、CTAB-LiCl法、硅藻土-STE法进行操作,琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱检测提取的RNA。通过对提取的总RNA实验操作过程、浓度、纯度以及完整性等方面的比较与分析,得出硅藻土-STE法是白腐真菌总RNA提取的理想方法。     

红豆杉属植物三种不同总DNA提取方法的分析比较

红豆杉属植物均为濒危物种,也是国家一级保护植物.以红豆杉属植物叶片为材料,利用三种不同的DNA提取方法提取总DNA,用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的得率和纯度,用PCR扩增的方法检测所得总DNA的质量,并对三种不同提取方法的结果进行了比较分析.结果表明:CTAB法提取的DNA纯度和得率均较高,可直接用...     

大青杨叶片总RNA的快速提取方法

目的:寻求快速提取大青杨叶片总RNA的方法。方法:分别用改良CTAB法、改良SDS法、改良TRIzol法及某公司总RNA提取试剂盒提取大青杨叶片总RNA,并用紫外光谱分析、凝胶电泳方法对提取的总RNA进行鉴定。结果:用改良CTAB法和改良TRIzol法能有效地去除蛋白及多糖,提取到的总RNA纯度高,D260nm/D280nm分别为2.05和1.78,RNA的完整程度优于试剂盒法。结论:改良CTAB法为大青杨叶片总RNA的最佳提取方法。     

两种适用于葡萄不同组织RNA提取方法的比较

以不同葡萄组织为材料对目前常用的2种总RNA提取方法一改良SDS法和CTAB-LiCl法进行研究。2种RNA提取方法中均不使用酚。采用这两种方法从葡萄不同组织中均成功地提取到RNA,琼脂糖凝胶电泳结果显示28s和18SrRNA条带完整清晰。检测A260/A280 值分布在1．7-2．0之间,A260/A230值分布于1．9-2．3之间,说明RNA质量较高。管家基Actin和ACS5基因的检测表明2种方法所得RNA能够满足RT-PCR和基因克隆等研究需要。改良SDS法的RNA得率是CTAB-LiCl法的RNA得率的2～3倍,而CTAB-LiCl法获得的RNA纯度高。可以根据原料的数量和对RNA质量的要求来选取最佳提取方法。     

风沙土微生物总DNA不同提取和纯化方法比较

为筛选和建立风沙土中总DNA的提取和纯化方法,选取了5种直接提取法、1种间接提取法和2种纯化法分别对风沙土中总DNA进行了提取和纯化,并对其质量和产量进行了比较.结果表明：6种方法均可从风沙土中提取到大小为23 kb左右的总DNA,其中改进后的高盐提取法（用40%聚乙二醇8000和4 mol·L^-1 NaCl沉淀DNA）效果最好,纯化后总DNA的纯度最高,可进行16S rDNA的PCR扩增,且产量仅稍低于试剂盒提取法;电泳加柱回收纯化法的纯化效果较好,经该方法纯化后的总DNA大部分可进行PCR扩增,可满足后续分子操作对DNA纯度的要求.     

石斛总RNA提取方法的研究

采用TRIZOL法、异硫氰酸胍法、Tris-硼酸法和改良的RNA提取方法提取石斛的总RNA,并通过凝胶电泳、紫外分光光度法检测提取的RNA样品的品质。研究结果表明:改良的RNA提取方法提取的RNA具有28S rRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解。OD260nm/OD280nm接近2.0,具有较高的纯度。其它三种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象。将改良的RNA提取方法提取的RNA逆转录成cDNA,经RAPD扩增,出现清晰的条带,进一步证明改良的RNA提取方法提取的RNA具有很高的纯度,可以满足进一步分子生物学研究的要求。     

Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量PCR检测中优于RNeasy mini kit（Qiagen）柱子法

目的比较RNeasy mini kit（Qiagen）柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 SYBRGreen PCR定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法。方法比较Trizol法,RNeasy minikit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green PCR方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法。结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA的A260/280低于1.8,其余3种方法的A 260/280在1.8～2.1之间,A 260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0。电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带：28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18 s带。RNA逆转录后进行荧光定量PCR,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠。而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现：Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带。结论鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信。对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠。     

土壤宏转录组RNA的提取方法评价

【目的】比较手工法和试剂盒法提取土壤RNA对原核微生物多样性的影响,评价两种方法研究土壤宏转录组的技术偏好性。【方法】针对黑龙江海伦砂质黑壤土、江苏滨海黏心夹砂土、江西鹰潭第四纪红黏土不同母质发育形成的三种水稻土,采用手工和试剂盒法分别获得微生物总RNA,利用高通量测序原核微生物16S r RNA多样性,通过紫外分光和琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量,比较手工和试剂盒法提取RNA对水稻土原核微生物群落的影响规律。【结果】三种水稻土中试剂盒提取RNA的纯度皆高于手工法,但RNA提取总量不一致。试剂盒提取黑龙江和江苏水稻土的RNA总量高于手工法,而手工法提取的江西水稻土RNA总量高于试剂盒法。高通量测序发现土壤类型而不是RNA提取方法决定了原核微生物多样性指数和群落结构。3个水稻土共检测到27门和409属,两种RNA提取方法偏好性提取了19门和181属,这些门和属占水稻土微生物总丰度平均值分别为40.4%和44.4%。与手工提取RNA相比,试剂盒法发现11个微生物门的丰度显著偏高(P0.05),但仅有Armatimonadetes门在三种水稻土同时存在专一偏好性;手工法提取也发现11个微生物门的丰度显著高于试剂盒法,并且仅有Firmicutes门在三种水稻土中同时存在专一偏好性。在微生物属水平,三种水稻土中均发现试剂盒法偏好性提取了2属,而手工法偏好性提取了5属。进一步针对72个优势微生物属(丰度0.1%且同时存在于三种水稻土),发现其占所有微生物丰度80%强,且48属的变化规律与RNA提取方法无关。例如,手工法提取水稻土好氧甲烷氧化菌的规律为:黑龙江(1.68%)江西(0.90%)江苏(0.59%),而试剂盒法也得到一致结果,黑龙江(0.52%)江西(0.18%)江苏(0.13%)。【结论】两种RNA提取方法本身的特异偏好性较小。三种水稻土27门409属中,仅有2门7属可能存在方法本身的专一偏好性,即在三种水稻土中,这些微生物均被试剂盒法或手工法特异性偏好提取,占所有原核微生物门和属比例仅为7%和1%左右。此外,针对同一水稻土,手工和试剂盒法提取RNA的总量、纯度、微生物相对丰度明显不同,在原核微生物门和属的分类水平,约70%的门和22%的属的丰度具有统计显著性差异,但两种RNA提http://journals.im.ac.cn/actamicro取方法均能反映优势微生物类群在三种水稻土中的变异规律,土壤类型对原核微生物多样性的影响远大于RNA提取方法本身的偏好性。未来原核微生物宏转录组研究中,应优先考虑科学问题及其实验处理可能导致的微生物组及其转录差异,结合微生物RNA提取特点,最大限度地发挥宏转录组技术优势。     

Enhanced sensitivity RNA gel loading buffer that enables efficient RNA separation on native gels

RNA gel analysis is essential for quality assessment of RNA preparations for subsequent analysis such as microarrays and real-time PCRs. The routinely used standard electrophoresis of RNA through formaldehyde-containing agarose gels is not only labor-intensive and time-consuming, but also involves sizeable quantities of hazardous materials. Above all, it is not sensitive, requiring more than 1 microgram of RNA for the assay. Current gene expression profiling with microarrays and real-time PCR often involves limiting amounts of RNA. It is therefore important to have a more sensitive way to analyze RNA. Here we report an improved ethidium bromide-based RNA gel analysis system with our Superload buffer that increases sensitivity to 12.5 ng of total RNA and allows RNA analysis on a regular native Tris-acetate EDTA (TAE) agarose gel.     

三种不同方法固定的石蜡切片中RNA的分析

研究在 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定的石蜡切片中提取RNA的质量和数量 .取 2 5 0g体重的Wistar大鼠的肾脏 ,分别采用 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定 ,石蜡包埋 ,H E染色 ;采用RNA裂解液、TRIZOL试剂 2种方法提取切片RNA ,逆转录为cDNA ,采用普通PCR和SYBRGREEN 1定量PCR分析RNA质量和数量 .结果表明 ,3种固定方法都可保持组织良好的结构和形态 ;采用 2种提取方法 ,均可经RT PCR扩增出 180bp大鼠磷酸甘油醛脱氢酶 (G3PDH)、5 6 5bpβ肌动蛋白 (β actin)、10 0bp纤溶酶系活化剂抑制物 1(PAI 1) ;但采用RNA裂解液时 ,比TRIZOL试剂可提取更多的RNA .     

琯溪蜜柚汁胞RNA提取方法的比较

比较了3种从琯溪蜜柚汁胞中提取RNA的方法,通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测,对提取所得RNA的完整性、纯度及浓度进行分析。试验结果表明,Trizol法适合琯溪蜜柚汁胞RNA的提取,能有效获得纯度高、完整性好的RNA样品,而且Trizol法步骤简单,RNA得率与质量均较高。通过RT-PCR检验表明该RNA适于后续分子生物学操作。     

乙醇保存的动物标本基因组DNA提取方法的比较

为提高从乙醇长期保存的动物标本中提取大分子DNA的质量,用5种不同方法对动物组织进行预处理实验,然后采用SDS／蛋白酶K裂解,酚一氯仿抽提和乙醇沉淀提取总DNA,通过0．8％琼脂糖凝胶对模板进行电泳和PCR产物作鉴定,经比较,用0．9％NaCL法、PBS法和混合液法进行预处理,消除乙醇对Taq酶的影响以及蛋白质和核酸交联问题,为提取动物基因组DNA的3种更理想方法。