鞘内注射一代和三代腺病毒载体免疫反应的比较

目的:比较鞘内注射第一代与第三代腺病毒载体后引起免疫反应的差异.方法:SD大鼠 随机分为对照组、第一代腺病毒载体(Ad-NEP)组、第三代腺病毒载体(HDAd-NEP)组.各组在 注射病毒或生理盐水后不同时间点,检测血清中IL-2、IL-6、TNF-α、IgG的浓度及脾脏中C D80表达情况.结果:各项检测指标在病毒或生理盐水注射前(0d),均无统 计学差异;IL-2、TNF-α、IgG等在注射后同一时间点,Ad-NEP组均高于HDAd-NEP组(P ＜0.0 5),且两组均高于对照组(P＜0.01);注射后1d、3d,Ad-NEP组的IL-6水平显著高于HDA d-NE P组(P＜0.05),且两组均高于对照组(P＜0.01);在注射后7d,Ad-NEP组CD80表达水平高于H DAd-NEP组(P＜0.05),两组均高于对照组(P＜0.01).结论:第三代腺病毒 载体也能引起一定程度的免疫反应,但第三代腺病毒载体引起的免疫反应要较第一代腺病毒载体引起的免疫反应弱.     

包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定

目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度测定。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR 方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列测定分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA 中均扩增出了约1 700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致,基因序列分析表明：第5 、10 、15 代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1ml。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

腺病毒载体的应用及进展

腺病毒载体是近年来继逆转录病毒载体之后被广泛应用的一个基因运载系统。它具有宿主细胞广泛、繁殖滴度高、不整合及相对安全等特点,在基因治疗中发挥越来越大的作用。本介绍了Ｅ１区缺失为特征的第一代腺病毒载体应用的有效性、安全性等方面的研究情况,和旨在克服第一代腺病毒载体不足的第二代载体构建方面的进展。     

表达猪γ干扰素的重组腺病毒的构建和活性鉴定

以刀豆素A(ConA)诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪γ干扰素基因(PoIFNγ,501bp)。测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与GenBank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100%。将PoIFNγ插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组。在293A包装细胞系中成功包装成完整的病毒粒子。将此重组后的腺病毒连续接种传至第10代,每代提取病毒基因组,PCR均能扩增出目的片段,以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性达1.3×106U/mL,证明该种表达猪γ-干扰素的重组腺病毒能稳定传代。     

鸡减蛋综合征病毒DNA的基因文库构建和酶切位点分析

腺病毒载体已经成为基因工程疫苗及癌症、遗传病基因治疗的重要工具。腺病毒可分为哺乳动物腺病毒和禽腺病毒,禽腺病毒包括20多个血清型,分别归属于三个群:Ⅰ群为传统的禽腺病毒(FAV),Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)等,Ⅲ群禽腺病毒为减蛋综合征病毒(EDSV)。这些病毒广泛地存在于多种禽类的呼吸道、消化道,大多呈显性或不显性感染。以禽类腺病毒为载体表达禽类重要病原的保护性抗原基因,构建多价(联)活载体基因工程疫苗,有其重要特点:腺病毒的某些毒株可以在禽体     

一种辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建及其在小鼠体内的应用

腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了目的基因在体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体ＨＡｄＩ－ｈＦＶＩＩ。该载体去除了病毒基因组的ｌ３、Ｌ１、Ｌ２、ＶＡＩ－ＶＡＩ、ｐＴＰ等基因序列。在第一代重组病毒ＡｄＩ－ｈＦＶＩＩ辅助下,能在２９３细胞包装和扩增。经氯化铯梯度超速离心后,能与辅助病毒有效分离。小鼠体内研究表明,该载体能在体内高效转移和表达ｈＦＶＩＩ基因。与笫一代腺病毒载体比较,外源基因表达稳定性明显提高,提示该载体在体内具有较低的免疫原性。     

腺病毒载体在疫苗研究中的应用

以病毒为载体的活疫苗为疾病预防和治疗研究提供了新手段。目前用于疫苗研究的病毒载体主要包括痘苗病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体及逆转录病毒载体等。其中,重组腺病毒载体因其基因组大小适中,易于基因重组操作,繁殖滴度高,易于大量制备和保存,宿主范围广,转导效率高,安全性好,能刺激机体产生强烈的体液和细胞免疫反应等特点,而被广泛应用于重要感染性疾病及恶性肿瘤的疫苗研究。腺病毒载体在人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗研究和临床试验中的成败更是备受关注。然而,与其他载体疫苗一样,机体对载体的免疫反应仍是阻碍腺病毒载体疫苗在临床中广泛应用的主要问题。那么,腺病毒载体解决这类问题的优势何在?我们简要综述腺病毒载体的特点及其在疫苗研究中的应用和存在的问题,为进一步优化和利用腺病毒载体在疫苗方面的研究提供参考。     

经NGR肽段遗传修饰的携带三种报告基因的腺病毒载体的构建及其实验研究

NGR(Asn-Gly-Arg)是通过噬菌体展示技术筛选出来的能够和肿瘤新生血管特异结合的三肽模体,可以将多种药物分子和病毒载体靶向运输到肿瘤或者进行血管再生的组织中。为此构建了腺病毒衣壳蛋白knob的HI环(HI-loop)经NGR肽段修饰的并同时表达三种报告基因的腺病毒载体Ad5/E1-mCherry/E3-luciferase-2A-eGFP/knob-NGR。体内、外实验研究表明,该病毒载体可成功表达三种报告基因;经NGR肽段修饰的腺病毒载体对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率高于未经修饰的对照腺病毒Ad5CMVeGFP。该载体的成功构建为进一步研究经NGR肽段修饰的腺病毒在肿瘤动物模型体内的靶向性及经NGR肽段修饰的并携带治疗基因的实验治疗研究奠定了基础。     

基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。