中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。     

几种南海芋螺二硫键异构酶的克隆及进化分析

目的:从来自中国南海的4种芋螺中克隆出包含完整3’和5’非翻译区的蛋白质二硫键异构酶(PDI)全基因序列,并对其进行序列及进化分析。方法:根据各种生物PDI基因的保守区域设计引物,利用3’和5’cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆出PDI全基因序列,并通过生物信息学方法对各芋螺PDI序列进行分析。结果与结论:从中国南海玉女芋螺、黑星芋螺、堂皇芋螺、桶形芋螺cDNA中克隆出包含有完整3’和5’非翻译区的PDI全基因序列;分析结果表明各芋螺之间的同源性大于90%,而与对虾、人类、酿酒酵母的同源性均小于60%;各芋螺PDI与其他生物的2个活性位点序列高度保守,而底物结合位点具有物种特异性,进化树显示各芋螺PDI的特征可能受其捕食食性影响。     

山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节.实验以标记的DNA片段为示踪材料,就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究.结果表明:山羊精子可自发性结合外源DNA,外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面,随后部分内化进入细胞内.精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显,在实验所检查的35只公羊中,结合率(DNaseⅠ消化前)波动于4.6%～62.4%,内化率(DNaseⅠ消化后)波动于2.1%～53.8%,个体间差异显著(P<0.01).对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,与射出的原精液相比,洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍;其次精子获能也将导致结合率和内化率降低(P<0.01).死精子不能完成外源DNA的内化过程,但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且阳性率与动物个体无关.上述结果提示,筛选合适的精子供体,采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证.     

新型α-芋螺毒素Di1.1的克隆、合成及功能研究

目的：从中国南海长距芋螺中克隆出新的芋螺毒素序列并用固相方法合成该毒素,测定其折叠后的二硫键配对方式并初步研究其药理学特性。方法：根据芋螺毒素A超家族保守的信号肽序列设计引物,通过3＇-RACE扩增,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因;采用Fmoc-固相法合成线性多肽,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式;用双电极电压钳技术初步研究其药理学特性。结果：发现-种新的α-芋螺毒素Dil．1的cDNA序列,其成熟肽序列为CcVIESCHSNHIDECES;该肽二硫键连接方式以C1-C4、C2-C3为主,以C1-C3、C2-C4连接为辅,对烟碱型乙酰胆碱受体各亚型活性较弱。结论：Dil．1是-种新的α4／7型芋螺毒素,其折叠方式以C1-C4、C2-C3连接为主。     

应用巢式RT-PCR检测血样中丙型肝炎病毒RNA

采用巢式RT-PCR(NT-PCR)检测HCVELISA阳性和阴性的全血标本,并与逆转录PCR(RT-PCR)的检测结果相比较。结果表明,采用巢式RT-PCR检测160例HCVELISA阳性标本HCVRNA的检出率为96.3±1.44,60例HCVELISA阴性标本HCVRNA的检出率为8.3±3.30;采用RT-PCR检测的检出率分别为58.8±5.08和1.7±6.70。结果提示,巢式RT-PCR是一种简便有效的提高RNA检测灵敏度的方法,适于临床血样中丙型肝炎病毒的RNA检测。     

新的J超家族芋螺毒素的克隆与进化分析

目的:从中国南海芋螺中克隆新的J超家族芋螺毒素,并进行序列和进化分析。方法:以芋螺毒腺管总RNA为模板,采用3′-RACE及巢式PCR的方法扩增J超家族芋螺毒素基因,并将得到的目的基因与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,经测序比对后,获得新的J超家族毒素,利用软件BioEdit、ClustalX及Mega5.05进行进化分析。结果:获得12个新的J超家族芋螺毒素前体肽序列,其氨基酸组成具有新颖性,在进化树上与已报道的J超家族毒素处于不同的进化分支。结论:12个新的J超家族毒素与已报道的毒素序列之间的同源性较低,是J超家族新成员。     

重组水疱性口炎病毒载体病毒包装体系的建立及优化

目的:建立并优化重组水疱性口炎病毒(VSV)载体病毒包装体系,以获得稳定高效的重组VSV载体疫苗包装系统。方法:以prVSVΔG-GFP为骨架载体,pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L为辅助载体,探索不同的骨架质粒及辅助质粒用量、包装细胞系、重组痘病毒vTF7-3作用时间、转染试剂作用时间等因素对重组VSV载体病毒包装的影响,用光学显微镜及荧光显微镜观测重组VSV载体病毒的包装效果,应用TCID50法测定重组VSV的滴度。结果:重组VSV的包装效率随着辅助质粒或包装质粒总量的减少而降低,293T细胞较BHK21-WI2细胞包装效率更高,适当延长重组痘病毒vTF7-3作用时间或转染试剂作用时间能提高VSV包装效率。优化的病毒包装条件为:选用293T细胞,v TF7-3以5～15 MOI感染细胞1 h或以5 MOI感染细胞1～4 h,总质粒用量为3.67～22μg,转染细胞6～14 h可获得高效包装的rVSVΔG-GFP。采用优化包装条件高效包装了rVSVΔG-ZE病毒。结论:获得了稳定高效的重组VSV包装体系,为重组VSV载体的疫苗研究奠定了基础。     

精子结合外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节。实验以标记的DNA片段为示踪材料,就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究。结果表明：山羊精子可自发性结合外源DNA,外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面,随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显,在实验所检查的35只公羊中,结合率（DNaseⅠ消化前）波动于4.6% ~ 62.4%,内化率（DNaseⅠ消化后）波动于2.1% ~ 53.8%,个体间差异显著（P<0.01）。对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,与射出的原精液相比,洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍;其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P<0.01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程,但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示,筛选合适的精子供体,采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。     

中国南海新α芋螺毒素Mr1.8的合成及二硫键测定

目的:采用固相方法合成新型α4/7芋螺毒素Mr1.8(PECCTHPACHVSNPELC-NH2),并测定其折叠后的二硫键配对方式。方法:采用Fmoc-固相法合成线性肽Mr1.8,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果:Mr1.8线性肽经折叠生成2种产物Ⅰ和Ⅱ,质谱和二硫键分析结果显示Mr1.8-Ⅱ为正确折叠产物,其二硫键框架为(Cys1-Cys3,Cys2-Cys4)。结论:Mr1.8是一种新的α4/7型芋螺毒素,其一种主要折叠产物的二硫键框架为(Cys1-Cys3,Cys2-Cys4)。