血管紧张素酶2在黄疸大鼠心脏中的表达

目的:研究阻塞性黄疸大鼠心组织中血管紧张素转化酶2(ACE2)的 mRNA 和蛋白质水平,探讨阻塞性黄疸大鼠心功能损害与 ACE2 的关系.方法:36 只 SD 大鼠随机分为假手术(SO)组(n=18)和胆总管结扎(BDL)组(n=18),于术后3d、7d、10d分别随机取 2 组大鼠的心组织(n=6),采用实时定量 PCR 方法和免疫组化方法检测心组织内 ACE2 的 mRNA 和蛋白质的表达水平.结果:(1)BDL组的总胆红素(TBIL)和肝功能指标(ALT)较 SO 组显著升高(P＜0.01),BDL 组中 7d 组 TBIL 为最高(158.65±10.80mmol/L)(P＜0.05),3d 组 ALT 为最高(236.07±12.49U/L)(P＜0.05);(2)BDL组心组织 ACE2 的 mRNA 水平较假手术组均呈一定程度的下降,其中 7d 组下降最显著(P＜0.01);(3)黄疸大鼠心肌纤维中 ACE2 的阳性率明显减少,且强度减弱,其中 7d 组减少最明显.结论:阻塞性黄疸大鼠心脏中的 ACE2 mRNA 和蛋白质水平均下调,可能是引起阻塞性黄疽后心功能损害的因素之一.     

人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达

目的:构建人神经生长因子信号肽与人β-内啡肽融合基因的真核表达载体,研究人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达.方法:取得人基因组后,PCR 法获取人的神经生长因子信号肽部分序列及人β-内啡肽序列;通过 SOE-PCR法将两段 DNA 序列连接,然后插入到真核表达载体内,测序正确后扩增转染级的真核表达载体.表达载体脂质体法转染 NIH3T3细胞,转染后 48-72h 收集细胞及培养上清,RT-PCR 法检测融合基因的转录.RIA 法测定细胞外β-内啡肽的浓度.结果:成功构建全人源的分泌型表达β-内啡肽的真核表达载体,DNA 序列经测序完全符合实验设计;融合基因能够顺利地得到转录并进行表达翻译,在细胞培养上清中可检测到其产物.结论:构建的真核表达载体能够分泌表达人β-内啡肽,提示人神经生长因子信号肽序列能够发挥其介导蛋白产物分泌表达的作用.     

第三代腺病毒载体的研究进展

第三代腺病毒载体(也称为空壳载体,辅助病毒载体等)的研究已近十年,它在研究中所表现出来的特点使大多数研究者认为它是一个很有希望的理想的基因治疗转导载体。但由于生产该类载体的生产系统比较复杂,影响因素多,至今仍不能提供临床级的病毒进行研究。该文首先总结了腺病毒(载体)的性质,回顾了第三代腺病毒载体的产生和研究历程,总结了各生产系统之间的改进与不同,以及第三代腺病毒载体在基因相关疾病中的具体应用,希望对以后空壳载体的发展有所帮助。     

表达人内啡肽的腺病毒/腺相关杂合病毒的构建及体外表达分析

应用分子生物学方法将人β_内啡肽融合基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒pDC312_AAVEE,后者与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装得到含转基因腺病毒腺相关杂合病毒AdAAV_EE。用PCR方法对杂合病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染体外培养细胞观察转基因表达,ELISA法测定培养液中表达产物浓度。PCR法证实转基因正确插入了杂合病毒基因组内,且没有野生型病毒污染,病毒滴度为1.29×1010PFUmL。结果表明转基因从第1天到第14天的表达水平呈上升趋势,第14天达到3141pgmL。     

鞘内注射一代和三代腺病毒载体免疫反应的比较

目的:比较鞘内注射第一代与第三代腺病毒载体后引起免疫反应的差异.方法:SD大鼠 随机分为对照组、第一代腺病毒载体(Ad-NEP)组、第三代腺病毒载体(HDAd-NEP)组.各组在 注射病毒或生理盐水后不同时间点,检测血清中IL-2、IL-6、TNF-α、IgG的浓度及脾脏中C D80表达情况.结果:各项检测指标在病毒或生理盐水注射前(0d),均无统 计学差异;IL-2、TNF-α、IgG等在注射后同一时间点,Ad-NEP组均高于HDAd-NEP组(P ＜0.0 5),且两组均高于对照组(P＜0.01);注射后1d、3d,Ad-NEP组的IL-6水平显著高于HDA d-NE P组(P＜0.05),且两组均高于对照组(P＜0.01);在注射后7d,Ad-NEP组CD80表达水平高于H DAd-NEP组(P＜0.05),两组均高于对照组(P＜0.01).结论:第三代腺病毒 载体也能引起一定程度的免疫反应,但第三代腺病毒载体引起的免疫反应要较第一代腺病毒载体引起的免疫反应弱.     

包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定

目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。     

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒/腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定

目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。     

腺病毒E3系列蛋白的作用及其机制

近年来,腺病毒作为载体广泛用于基因治疗,其E3转录单位编码的各种蛋白在保护感染细胞免受细胞毒性T细胞和诱导细胞凋亡的细胞因子对细胞的杀伤起重要作用,利于基因的长期表达。该文主要就腺病毒E3系列蛋白的作用及其机制加以阐述。