糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响

为了研究糖化作用对新城疫病毒(NDV)HN糖蛋白生物学活性的影响,特别是对HN促细胞融合作用的影响,采用基因定点突变技术分别去掉HN分子上的4个糖化位点,然后检测各突变株的细胞表面表达情况、受体识别特性、神经氨酸酶活性、促细胞融合作用、免疫沉淀特性等.结果表明,将野毒株NDV HN的细胞表面表达效率定为100%时,D198R-HN突变株的表达效率为82.6%;而对二者的G1、G2、G3和G4 4个糖化位点分别进行定点突变时,得到8种突变株.它们的表达效率均有不同程度的降低,D198R-HN-G2和D198R-HN-G4两种突变株与D198R-HN相比更为明显.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变株的受体识别活性分别为突变前的47.95%、68.49%、42.67%和41.10%;而D198R-HN突变株的G1、G3和G4突变株的受体识别活性突变前后变化不明显,只有D198R-HN-G2突变株的受体识别活性得以恢复较多,从原来的10.96%恢复到32.88%.野毒株HN突变后神经氨酸酶活性普遍降低,尤以G4影响明显,仅为野毒株的9.60%;而D198R-HN突变株突变后神经氨酸酶活性普遍升高,尤以G2恢复最高,由原来的0.45%恢复到7.59%.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变前后细胞融合情况变化不大;而D198R-HN的G1、G2、G3和G4突变后,D198R-HN-G1、D198R-HN-G3、D198R-HN-G4没有变化,但D198R-HN-G2使D198R-HN的细胞融合活性得以恢复30.90%.野毒株HN电泳时呈现1条较宽的泳带,当突变掉1个糖化位点时,泳动速度加快.D198R-HN突变株及D198R-HN-G1、D198R-HN-G3和D198R-HN-G4 HN突变株电泳时,呈现两条模糊不清的条带.但D198R-HN-G2突变株HN电泳时,其条带变得窄而锐利,且泳动速度快.上述结果说明糖链能影响HN的表达或从细胞浆运输到细胞表面,G2对HN的受体识别活性影响较大,推测G2糖链部分结构的改变影响到了HN G2周围的表型特性,从而导致神经氨酸酶活性、促细胞融合作用的改变.     

人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重复序列保守氨基酸突变分析

为确定人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,hPIV3)病毒包膜表面血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)糖蛋白茎部区十一肽重复序列中保守氨基酸中具有关键性作用的位点,进一步探讨HN蛋白茎部区在融合机制中的重要作用。结合定点突变和同源重组技术将HN蛋白茎部区十一肽重复序列中5个保守氨基酸位点(I102、P111、L114、S119、I125)突变为丙氨酸(Alanine,A),通过痘苗病毒-T7聚合酶系统在BHK-21细胞中表达突变蛋白,定性定量检测各突变体蛋白的促细胞融合活性、受体结合活性、神经氨酸酶活性和半融合活性。突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的促细胞融合活性均有不同程度下降,依次为野生型的6%、16%、14%、87%和4%,除S119A外其余4个突变型与野生型相比差别均具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的受体结合活性也出现不同程度下降,依次分别为野生型的32.2%、77.4%、74.2%、83.9%和38.7%,其中I102A和I125A的受体结合活性与野生型相比差别具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的神经氨酸酶活性分别为野生型的66.5%、73.1%、69.1%、76.1%和72.8%,与野生型相比差别无统计学意义(P0.05)。结果表明:茎部区十一肽重复序列对hPIV3HN蛋白的促细胞融合活性和受体结合活性具有重要意义。该区域氨基酸I102、P111、L114、I125具有关键作用,推测其能通过影响头部区受体结合活性或是与融合蛋白的相互作用等不同方式导致HN蛋白结构功能发生改变。     

副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区功能的研究

副粘病毒(Paramyxovirus)包膜上镶嵌着两种糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F),两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键。为探讨HN颈部与F相互作用区(Fusion interaction region,FIR)在膜融合机制中的作用,选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)与人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)为研究对象,通过片段置换及同源重组技术构建嵌合体C1、C2,进一步将NDV及hPIV3 HN的FIR内第51位丝氨酸(Serine,S)、第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D)定点突变为丙氨酸(Alanine,A),获得突变体NDVS51A、NDVD55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A,对嵌合体及突变体蛋白的细胞表面表达效率、受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及半融合活性进行检测。结果:各嵌合体C1、C2及突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的细胞表达效率、神经氨酸酶活性(Neuraminidase,NA)与野生型相比差异不显著(P0.05),但促细胞融合活性均有不同程度的降低(P0.05),C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A分别为野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%;C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的受体识别活性分别为14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,与野生型相比差异显著(P0.05)。结果表明:副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区的突变及置换使HN蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性降低,其中第51位丝氨酸(S51)及第55位天冬氨酸(D55)发挥重要作用。     

副流感病毒5包膜糖蛋白的结构与功能

副流感病毒5(Parainfluenza virus 5,PIV5)属于单股负链不分节段的RNA病毒,迄今尚未发现PIV5与人类已知的疾病有关,主要被用作疫苗载体。其包膜上存在三种糖蛋白:融合(Fusion,F)蛋白、血凝素-神经氨酸酶(Hemaggulatinin-neuraminidase,HN)蛋白、小疏水性(Small hydrophobic,SH)蛋白。F蛋白能在同源性HN蛋白的协助下介导膜融合,HN蛋白具有受体识别、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性,SH蛋白则在病毒致病机制中起作用。本文主要阐述了三种包膜糖蛋白的结构和功能,旨在为PIV5的研究提供一些参考。     

Man8GlcNAc2糖基化的酿酒酵母菌株的构建

酿酒酵母糖蛋白的N-糖基化经过高尔基体的修饰后形成聚合度约150-200的甘露寡糖,高尔基体N-糖基化的糖基转移酶Mnn1p和Och1p在甘露寡糖的形成过程中起关键作用。通过同源重组置换敲除了酵母中的MNN1和OCH1基因阻断高尔基体N-糖基化修饰,分离纯化了mnn1 och1突变株中的N-糖蛋白,糖酰胺酶PNGaseF酶解释放的N-糖链经过2-氨基吡啶衍生后,利用HPLC和MALDITOF/MS结合的方法分析了突变株糖蛋白上的N-糖链。结果显示mnn1 och1突变株中的糖蛋白的N-糖链为结构单一的糖链,分子量为1794.66,推测为Man8GlcNAc2。     

副粘病毒F1蛋白胞外非保守区对其特异性膜融合的影响

为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素．神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体：NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-1C和NDV—C2分别与NDV HN共表达后,融合功能达到野毒株的76．34％和96．2％,与hPIV HN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV—C2分别与hPIV HN共表达后,融合功能达到野毒株的65．82％和93．78％,与NDV HN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDV F-1和hPIV F-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDV F-2和hPIV F-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。     

IgG Fc糖链与功能的关系及疫苗接种的调节作用

免疫球蛋白G(immunoglobulin G,Ig G)是免疫系统的重要成分,是B细胞产生的糖蛋白,糖基化位点位于Fc段第297位氨基酸天冬酰胺上。糖链组成具有不均一性,末端组分变化可以影响抗体功能,并受多种因素的调节,如疫苗接种可以调节Fc段糖链修饰,进而影响抗体与Fc受体或补体的结合,从而对抗体的功能产生影响。本文就Ig G Fc糖链的组成、糖链与功能的关系、疫苗接种对糖链修饰的调节及对功能的影响作一综述。     

Man8GlcNAc2糖基化的酿酒酵母菌株的构建

酿酒酵母糖蛋白的N-糖基化经过高尔基体的修饰后形成聚合度约150-200的甘露寡糖,高尔基体N-糖基化的糖基转移酶Mnn1p和Och1p在甘露寡糖的形成过程中起关键作用。通过同源重组置换敲除了酵母中的MNN1和OCH1基因阻断高尔基体N-糖基化修饰,分离纯化了mnn1 och1突变株中的N-糖蛋白,糖酰胺酶PNGaseF酶解释放的N-糖链经过2-氨基吡啶衍生后,利用HPLC和MALDITOF/MS结合的方法分析了突变株糖蛋白上的N-糖链。结果显示mnn1 och1突变株中的糖蛋白的N-糖链为结构单一的糖链,分子量为1794.66,推测为Man₈GlcNAc₂。     

新城疫分离毒HN蛋白的抗原性初步分析及分子特性研究

运用针对NDV囊膜糖蛋白(HN)的单克隆抗体(MAbs),对2005～2006年间自我国江苏和广西部分地区的20株NDV分离株进行排谱试验,初步分析了不同毒株之间HN蛋白的抗原表位差异;并应用RT-PCR技术成功扩增了其HN基因整个编码区,经克隆、测序最终获得13株鸡源NDV与7株鹅源NDV HN基因的编码区序列,分析测定核苷酸序列及推导的氨基酸序列,并将鹅源NDV与鸡源NDV相应序列进行了比较.结果单抗排谱试验表明,20株NDV分离株之间HN蛋白的抗原表位存在差异;测序结果表明,测定的HN基因的编码区长度皆为1716nt编码571个氨基酸;分离株中18株基因Ⅶ型NDV分离株之间HN基因编码区核苷酸序列具有较高的同源性,达94.8%～100%;与近几年国内流行的其它基因Ⅶ型NDV之间的核苷酸序列同源性为92.1%～99.6%.对其推导的HN蛋白一级结构中潜在的糖基化位点及HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列等进行了比较分析.结果显示,单抗排谱差异显著株在部分氨基酸位点发生了突变;同时揭示我国部分地区同期流行的鹅源NDV与鸡源NDV HN基因之间具有较近的亲缘关系.     

GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞HepG2炎症相关分子信号通路的影响

目的:通过构建高尔基体膜蛋白73(GP73)氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒,研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法:根据GP73的DNA序列,设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物,以本实验室构建的野生型质粒pc DNA3-Flag-GP73为模板,构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM);用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞,用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况,用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对Hep G2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果:糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白,且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失;双萤光素酶报告基因实验结果表明,野生型GP73能够激活Hep G2细胞中NF-κB的转录活性,而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论:构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路,糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。     

新城疫分离毒HN蛋白的抗原性初步分析及分子特性研究

运用针对NDV囊膜糖蛋白(HN)的单克隆抗体(MAbs), 对2005~2006年间自我国江苏和广西部分地区的20株NDV分离株进行排谱试验, 初步分析了不同毒株之间HN蛋白的抗原表位差异; 并应用RT-PCR技术成功扩增了其HN基因整个编码区, 经克隆、测序最终获得13株鸡源NDV与7株鹅源NDV HN基因的编码区序列, 分析测定核苷酸序列及推导的氨基酸序列, 并将 鹅源NDV与鸡源NDV相应序列进行了比较。结果单抗排谱试验表明, 20株NDV分离株之间 HN蛋白的抗原表位存在差异; 测序结果表明, 测定的HN基因的编码区长度皆为1716nt编码571个氨基酸; 分离株中18株基因Ⅶ型NDV分离株之间HN基因编码区核苷酸序列具有较高的同 源性,达94.8%~100%; 与近几年国内流行的其它基因Ⅶ型NDV之间的核苷酸序列同源性 为92.1%~99.6%。对其推导的HN蛋白一级结构中潜在的糖基化位点及HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列等进行了比较分析。结果显示, 单抗排谱差异显著株在部分氨基酸位点发生了突变; 同时揭示我国部分地区同期流行的鹅源NDV与鸡源NDV HN基因之间具有较近的亲缘关系。     

流感病毒识别糖链受体分子机制的研究进展

近年来,由于流感病毒(influenza virus)不可预测的局部流行和有可能引发全球大流行,其一直是研究的热点课题之一．流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础．影响流感病毒宿主特异性的两个主要因素是HA自身的变化(包括基因突变、重组、糖基化位点数量和糖基化位置的变化)和宿主细胞表面糖链受体的变化(包括糖链受体的类型、分布和分子构象的改变)等．因此准确掌握这些信息有助于人们进一步加强对流感病毒的防控．本文主要从糖组学角度概述了流感病毒识别糖链受体的分子机制,重点介绍流感病毒宿主细胞表面糖链受体的研究进展．     

丙种免疫球蛋白Fc段糖基化及其生物学活性和功能

丙种免疫球蛋白是血清中重要的糖蛋白,在IgG Fc的297位天冬酰胺位点存在重要的糖基化,连接的糖链能维持IgG重链构像并调节Fc和FcγR结合能力,异常的糖链改变某些蛋白质的抗原特性,激活补体,介导炎症引起免疫失衡.多种疾病都可能伴有异常糖苷化或因缺少糖苷化酶引起.糖苷的功能结构研究已取得一定进展,进一步研究IgG的Fc段不同糖基化对IgG晶体结构及其生物学功能的影响将有助于设计新型生物制品.本文就近年来丙种免疫球蛋白Fc段糖基化及生物学活性与功能、糖蛋白寡糖链等研究进展作一综述.     

狂犬病毒糖蛋白cDNA在BHK细胞中的整合及表达

狂犬病毒是引起动物及人狂犬病的病原。病毒颗粒由脂质囊膜、核糖核蛋白核心和纤状突起(糖蛋白又叫G蛋白)组成。G蛋白为病毒粒子的重要成分之一,具有血凝活性,并提供毒粒吸附宿主细胞受体的位点,其成熟形式含有505个氨基酸。依毒株不同,该蛋白上有2或3个潜在糖基化位点。糖蛋白既是病毒特异性辅     

N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列

蛋白质的N-糖基化修饰是生物体调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性的一种普遍的翻译后方式。N-糖基化位点是理解糖链功能的重要前提之一。应用新的糖蛋白、糖肽富集技术和质谱技术,科学家们在不同组织中完成了对N-糖基化位点的鉴定。此外,不同于经典三联子的N-糖基化序列的发现使人们对N-糖基化过程的认识向纵深发展。     

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。     

汉滩病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体重组假病毒的构建及初步鉴定

目的：为进一步研究汉坦病毒包膜糖蛋白的糖基化与病毒的感染性和免疫原性等的关系,构建含有汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白（GP）糖基化位点突变体的重组假病毒。方法：利用定点突变的方法,分别突变了HTNV 76-118株的5个N-糖基化位点并克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染293T细胞,构建5株重组假病毒。感染HEK293细胞后,进行RT-PCR鉴定及免疫荧光检测。结果：经测序显示构建的含有N-糖基化位点突变体的5个重组假病毒原序列中的天冬酰胺（N）均被置换为谷氨酰胺（Q）。RT-PCR结果显示5个重组假病毒均有HTNV GP基因的表达。免疫荧光检测5个重组假病毒均可表达HTNV的Gn和Gc蛋白。结论：成功构建了含有HTNV包膜糖蛋白糖基化位点突变体的5个重组假病毒,分别命名为rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4和rLV-M5。本研究为明确N-糖基化对汉坦病毒生物学活性的影响提供了有利的研究工具,并为汉坦病毒疫苗及致病机理的进一步研究打下了一定的基础。     

蛋白质糖基化表达体系及应用

糖基化对治疗性蛋白质的溶解度、稳定性、半衰期、活性等具有重要的影响。选择合适的表达载体对蛋白质进行合适的糖基化修饰,可以大大提高治疗效果和降低毒副作用。该文主要介绍糖链对糖蛋白性质的影响,各种糖蛋白表达载体的优势和不足,并简要探讨糖基化工程在生物制药中的应用。     

凝集素法与酰肼法富集糖肽的方法学比较

蛋白质糖基化(glycosylation)是最常见和最重要的翻译后修饰之一.大规模N-连接糖基化位点鉴定是糖蛋白质组学研究的重要组成部分,而N-连接糖肽富集是高通量N-连接糖基化位点鉴定的关键步骤.凝集素富集法和酰肼化学法是目前被广泛应用的N-连接糖肽富集技术,有报道认为两种方法具有很强的互补性,联合使用能提高糖基化位点的鉴定数目.本文以Hep G2细胞系为模型,系统比较了这两种方法的富集效率和糖蛋白鉴定数目.结果表明,虽然酰肼法的糖肽富集效率为76.6%,远高于凝集素法的54.6%,但是凝集素法却能鉴定到825个糖蛋白和1 959个N-连接糖基化位点,显著多于酰肼法富集到的522个糖蛋白和1 014个糖基化位点.并且,两种方法并未显示出显著的互补性,仅28个糖蛋白和80个糖基化位点未在凝集素法中鉴定到.     

H7N2禽流感病毒HA的分离纯化及其糖链谱研究

血凝素(HA)是位于流感病毒囊膜表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,是流感病毒结合宿主细胞表面受体,介导病毒入胞的关键分子,也是中和抗体以及疫苗研制的重要靶标.HA表面糖基化与病毒毒力、感染宿主范围等密切相关,且其表面糖链变化会影响其结构与功能.然而目前关于流感病毒HA糖基化的研究主要集中在其糖基化位点上,而对于HA上详细的糖链结构知之甚少.本文应用禽流感病毒特异识别的唾液酸糖链(SAα2-3Gal)受体,制备特异的糖链磁性微粒复合物,进而从H7N2禽流感病毒中分离纯化HA,并采用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.确定提取物系HA后,进一步利用凝集素芯片联合质谱技术研究禽流感病毒H7N2的HA表面糖型,结果显示H7N2禽流感病毒HA表面主要含有岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰葡糖胺等糖链结构,共获得16个糖链结构较为准确的寡糖,这些糖链可能与HA生物学功能相关.本研究有助于揭示禽流感病毒感染宿主的糖链作用机制,有助于设计制备针对HA相关的糖链疫苗.